[发明专利]德谷胰岛素生物学活性的检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测领域，特别涉及德谷胰岛素生物学活性的检测方法及检测试剂盒。本发明通过含有胰岛素受体的细胞进行体外培养来检定德谷胰岛素生物活性，细胞培养后，加入制备好的不同浓度的待测样品及标准品与细胞相互作用，加入含抑制剂裂解液对细胞进行裂解，裂解后将细胞裂解液转移到已用抗体包被好的包被检测板中，结合，加入PY‑20报告抗体，再加入显色液显色，最后终止液终止反应，多功能酶标仪进行读数。本发明提供的方法通过ELISA试剂盒来进行实验，与现有技术的体外细胞及小鼠血糖试验相比，不容易受到外源因素的影响，缩短了检测时间，提高了实验结果的准确度。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及德谷胰岛素生物学活性的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

根据国际糖尿病联盟(IDF)统计，2019年全球约4.63亿20-79岁成人患糖尿病。胰岛素作为治疗糖尿病的主要用药历史悠久，基于降低药物免疫原性、更好的模拟胰岛素生理分泌的研发理念，胰岛素系列产品经历了动物胰岛素、人胰岛素、胰岛素类似物三代产品的更迭，众多糖尿病患者因此受益，生活质量有了显著提高。

德谷胰岛素是新一代胰岛素类似物：人胰岛素分子结构上去掉B30位的苏氨酸，通过一个L-γ-谷氨酸连接子，在B29位赖氨酸上将一个16碳脂肪二酸链接，从而获得的一种超长效胰岛素类似物。这种结构可使其以稳定的、可溶性、双六聚体形式存在于制剂(含锌、苯酚及间甲苯酚等物质)中，皮下注射后，苯酚迅速弥散，德谷胰岛素形成多六聚体沉积在注射部位，形成储存库，成为主要的延迟作用机制，随着时间的延长六聚体逐渐解离成单体，单体弥散进入毛细血管，与白蛋白结合使其在血液中得到缓冲，成为次要的延迟作用机制，到达靶器官后，德谷胰岛素与蛋白解离，与亲和力更高的胰岛素受体结合，激活胰岛素受体发挥药效。

在药物的研制过程中，生物学活性检测方法是药物筛选以及质量控制的重要评价指标，该方法必须通过方法验证，满足专属性、精密度、准确度等方法验证方面的要求，这样才能保证生物学活性检测结果的可靠性，才能用于指导药物的筛选以及质量控制，因此建立切实可靠的生物学活性检测方法，对于德谷胰岛素注射液研究开发、质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了德谷胰岛素生物学活性的检测方法及检测试剂盒。本发明提供的检测方法是通过体外细胞检定法来检测德谷胰岛素生物学活性，与现有技术的体外细胞及小鼠血糖试验相比，不容易受到外源因素的影响，缩短了检测时间，提高了实验结果的准确度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了德谷胰岛素生物学活性的检测方法，包括如下步骤：

步骤A：取含有胰岛素受体的细胞复苏、传代、铺板、过夜培养；

步骤B：取捕获抗体经包被缓冲液稀释后铺板，封板后避光孵育过夜；

步骤C：取标准品和供试品经系列梯度稀释，分别转至清洗后的步骤A 获得的细胞板，封板后孵育，再经裂解液裂解，获得细胞裂解液；

步骤D：取步骤B获得的检测板清洗后经封闭液封闭后培养、去除封闭液、清洗，转入步骤C获得的所述细胞裂解液，培养；

步骤E：清洗后，加入报告抗体孵育；去除所述报告抗体，清洗，经显色液显色，避光孵育，再加入终止液，检测，获得EC50值；

根据所述标准品EC50值、所述供试品EC50值、标准品标示比活、所述标准品的起始浓度和所述供试品的起始浓度，获得所述德谷胰岛素生物学活性。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤A中所述铺板的细胞密度包括 5×10⁴个/ml～1×10⁵个/ml，以100μl/孔铺板。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤A中所述铺板的细胞密度为 7.5×10⁴个/ml。