[发明专利]一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法

说明书

本发明公开了一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，包括以下步骤：（1）选取体型适中且健康的暗纹东方鲀稚鱼，对鱼体进行消毒后，无菌操作解剖取得肾脏组织；（2）在含青霉素‑链霉素双抗溶液的培养液中清洗，剪碎，在含EDTA的胰蛋白酶中37℃消化，消化后收集到灭菌离心管中，离心后得到肾细胞沉淀；（3）向细胞沉淀中加入适量预温的含暗纹东方鲀血清的完全培养液，得到重悬浮的细胞悬液，转入多聚赖氨酸预处理的细胞培养瓶中培养；本发明首次成功培养出暗纹东方鲀原代肾细胞，所构建的肾细胞原代培养方法简单，培养所需材料易获取，细胞贴壁时间短，生长形态良好，为暗纹东方鲀新品种选育、病害防控、免疫基因功能等研究提供细胞水平材料。

技术领域

本发明属于鱼类细胞原代培养技术领域，具体涉及一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法。

背景技术

暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus），俗称河鲀，是我国江浙地区特色水产养殖品种，随着国家对河鲀食用解禁和纳入国家产业体系，产业发展不断加速。而随着暗纹东方鲀养殖业的蓬勃发展，寄生虫和细菌性等疾病频繁爆发，经济损失严重，极大限制了暗纹东方鲀产业的发展。由于暗纹东方鲀至今还没有建立稳定的细胞系，原代细胞成为新品种选育和病害防控等细胞水平研究过程中的首选材料。

鱼类肾脏是鱼体中重要的免疫器官，一般分为头肾和后肾，鱼类中头肾主要在造血和免疫应答中发挥作用，而后肾主要承担排泄与平衡渗透压的功能时具有造血功能。原代培养的肾细胞离体时间短，能很好的保留和维持鱼体细胞的原始状态和细胞功能，成功体外培养后可以比组织层面更精准的反应机体的免疫应答情况，是免疫分子功能研究的优选组织。多种鱼类已在原代肾细胞的基础之上建立了稳定的肾细胞系。目前还没有暗纹东方鲀肾细胞培养方法的报道。因此，通过暗纹东方鲀肾细胞的原代培养，在细胞层面研究病害发生的免疫和分子机制，对抗病新品种的选育和病害防控具有重大意义。

然而本实验室前期利用已报道的鱼类及哺乳动物细胞分离和培养方法，未能很好地获得暗纹东方鲀原代肾细胞，所培养的肾细胞贴壁缓慢、细胞形态差且存活时间短。经过对原代细胞培养方法的不断改进和创新，通过反复试验，我们最终实现了暗纹东方鲀原代肾细胞的稳定培养，此方法获得的原代肾细胞贴壁时间短、细胞形态良好均一、存活时间长，符合原代细胞培养要求且能进行一系列的下游实验，可用于暗纹东方鲀免疫学及相关的分子、细胞生物学研究。

发明内容

为解决暗纹东方鲀肾细胞离体培养存在难贴壁、难存活的现象，本发明公开了一种稳定的暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）暗纹东方鲀稚鱼的选取：选取健康的暗纹东方鲀，在非应激状态下饥饿24小时；

（2）细胞培养载体的预处理：使用多聚赖氨酸预处理细胞培养载体底面，细胞级无菌水清洗细胞培养载体底部，晾干细胞培养载体备用；

（3）肾组织的处理：将肾组织放置于含青霉素-链霉素的D-Hanks液中，清洗处理后剪碎；含青霉素-链霉素的D-Hank’s液中青霉素-链霉素的浓度为2%（v/v）；

（4）肾组织的消化：剪碎后的肾组织转移至含EDTA的胰蛋白酶中消化，消化后用细胞滤网过滤，用含胎牛血清的细胞培养液冲洗细胞滤网，同时终止消化，离心后弃上清，得到细胞；含胎牛血清的细胞培养液包括：RMPI 1640 基础培养基中包含20%（v/v）胎牛血清、1%（v/v）青霉素-链霉素双抗溶液；

（5）原代培养：向细胞中加入适量的完全培养液，用移液枪反复轻轻吹打混匀，将细胞悬液转入细胞培养载体中，置于细胞培养箱培养。

进一步地，步骤（1）中暗纹东方鲀稚鱼的体长为15±3cm，体重为100±20g。