[发明专利]一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法

权利要求书

1.一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）暗纹东方鲀稚鱼的选取：选取健康的暗纹东方鲀，在非应激状态下饥饿24小时；

（2）细胞培养载体的预处理：使用多聚赖氨酸预处理细胞培养载体底面，细胞级无菌水清洗细胞培养载体底部，晾干细胞培养载体备用；

（3）肾组织的处理：将肾组织放置于含青霉素-链霉素的D-Hanks液中，清洗处理后剪碎；

（4）肾组织的消化：剪碎后的肾组织转移至含EDTA的胰蛋白酶中消化，消化后用细胞滤网过滤，用含胎牛血清的细胞培养液冲洗细胞滤网，同时终止消化，离心后弃上清，得到细胞；

（5）原代培养：向细胞中加入适量的完全培养液，用移液枪反复轻轻吹打混匀，将细胞悬液转入细胞培养载体中，置于细胞培养箱培养。

2.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原`代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，步骤（1）中暗纹东方鲀稚鱼的体长为15±3cm，体重为100±20g。

3.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，步骤（2）中细胞培养载体的预处理具体包括以下步骤：多聚赖氨酸（Poly-D-lysine）用细胞培养级无菌水稀释为0.1mg/ml的浓度，浸润细胞培养载体底面30分钟后，用细胞培养级无菌水清洗，细胞培养载体底面仅留存一层极薄的多聚赖氨酸，无菌环境中12小时自然晾干备用。

4.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，步骤（3）中，清洗处理时，需要仔细剔除肾动脉、肾静脉以及肾脏表膜并尽可能清洗组织中残余血液。

5.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，步骤（4）中含EDTA胰蛋白酶的浓度为0.25%（w/v），剪碎的肾组织于37℃消化，消化时间为30-50分钟，消化期间每隔5min用无菌枪头轻轻搅拌混匀一次，消化后的肾组织成浆状，可以直接通过100µm细胞滤网。

6.根据权利要求1所述的一种暗纹东方鲀原代肾细胞贴壁培养方法，其特征在于，步骤（5）中，完全培养液包括：RMPI1640基础培养液中加入胎牛血清、暗纹东方鲀血清、青霉素-链霉素双抗；完全培养液中，胎牛血清所占比例为15-20%（v/v），暗纹东方鲀血清所占比例为1-5%（v/v），青霉素-链霉素双抗溶液所占比例为1-3%（v/v）。