[发明专利]溪荪花部建立病毒诱导基因沉默体系的方法

说明书

本发明公开了一种鸢尾属植物溪荪花部上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，涉及鸢尾属植物花色、花型改良的基因工程领域，最佳接种部位是未着色花苞时期，侵染液需先用现配，在侵染液的配制中提高了携带病毒载体的农杆菌的菌体浓度至OD₆₀₀到1.8‑2.0。保证了在自然条件下接种区域内携带病毒载体的农杆菌具有足够的存活基数，提高了整个实验的侵染效率，接种后无需闭光。本方法高效、易操作，且解决了没有遗传转化体系的溪荪基因功能研究的方法，是通过溪荪本体植物解析其基因分子调控机理的有效手段。

技术领域

本发明涉及溪荪花部性状改良的基因工程领域，具体地说是一种在溪荪植株花部建立病毒诱导基因沉默体系的方法。

背景技术

溪荪(Iris sanguinea)为鸢尾科鸢尾属多年生草本植物。由于其极强的抗寒能力和较高的观赏价值一直被认为是东北地区亟待开发的一种重要园林绿化和切花植物，已在多地作为观赏植物广泛应用。虽然我们在溪荪花色育种中取得一系列成果，但由于溪荪等单子叶植物遗传转化体系建立非常困难，花色基因功能验证只能通过烟草、矮牵牛等异源植物来实现，这使得其花色调控机理研究进展较慢，特殊花色育种一直很难有所突破。

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可引起内源mRNA序列特异性降解。烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus)介导的VIGS因其寄主范围广、构建方便、效果明显，已成为目前应用范围最广的病毒载体，VIGS已作为一种高效的反向遗传学新技术应用于很多植物花色基因功能研究，包括蝴蝶兰、矮牵牛、月季和番茄等，非常适合缺乏稳定遗传转化体系的物种进行基因功能分析，并已经在多个植物的生长发育过程的关键基因功能研究中成功使用。当前，还未曾报道过以多年生的大田鸢尾为实验对象建立病毒诱导基因沉默体系的研究，利用VIGS技术建立溪荪基因功能研究的技术体系，可能是通过溪荪本体植物解析基因分子调控机理的有效手段。

发明内容

为解决上述存在的技术问题，本发明提供了一种以大田条件下溪荪植株为实验对象建立其花部病毒诱导基因沉默体系的方法，本方法简单高效，且易于在室外进行操作。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

(1)确定接种时期：大田溪荪处于花苞未着色时期，接种时间为晴朗无风的下午3点以后；

(2)配制侵染液：侵染液现用现配，配制方法如下：

首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于1ml YEB液体培养基中，该培养基中含有卡那霉素50μg/mL、利福平20μg/mL，28℃条件下，在带橡胶塞的玻璃试管中200r/min震荡6-8h至浑独而不泛白；

其次，将摇至浑浊的菌液分别再用50mL YEB液体培养基培养，该培养基中含有卡娜霉素50μg/mL、利福平20μg/mL，200r/min条件下震荡，在菌液浓度达OD₆₀₀到1.8-2.0时取出；

然后，离心收集菌体，均用25mL侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以无菌水作为溶剂，其中含有MES 10mM、AS 200μM、MgCl₂ 10mM，调节农杆菌液浓度菌液浓度达OD₆₀₀到1.8-2.0，制成农杆菌侵染缓冲液，缓冲液OD₆₀₀为0.8-1.0为最佳；

最后，将含有等浓度pTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2-目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合，黑暗条件下室温静置，形成两种农杆菌侵染液；

(3)接种部位的选择：选择溪荪未着色时期的花苞为接种部位；

(4)病毒载体的接种：采取1mL注射器，先自花苞顶部扎入一个伤口，再用针头将1mL侵染液注射到溪荪的花苞中，保证花苞直立，菌液不会留出，接种后无需避光，挂牌注明处理组别及处理时间；