[发明专利]一种极度濒危植物荔波杜鹃的组培繁殖方法

说明书

本发明公开了一种极度濒危植物荔波杜鹃的组培繁殖方法，该方法适用于杜鹃花科荔波杜鹃的组培快繁，属植物生物技术领域。本发明以当年发枝的当年新发嫩茎段，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、分化、壮苗及生根一系列步骤，有效解决了极度濒危植物荔波杜鹃种群稀少，引种驯化难的问题。本发明提供的组培快繁方法，在1个月内增殖系数为10‑20，生根率为80%‑90%，移栽成活率为88%‑94%，极大地提高了荔波杜鹃的繁殖系数，以更大的量和更快的速度提供大量的回归小苗，实行抢救性的保护，缓解了该濒危物种的灭绝的现状。

技术领域

本发明涉及植物生物技术中植物组织培养方法，具体地说，涉及一种濒危植物荔波杜鹃的组织培养快繁方法。

背景技术

荔波杜鹃隶属于杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属( RhododendronL.)，是在 1997年首次被发现，2003年正式发表的一个杜鹃花科新种，其分布在贵州省茂兰国家级自然保护区的特有杜鹃种类，据陈正仁等报道该种仅分布在保护区内洞化山，总数约 37 株，在国际植物园保护联盟（BGCI）2013 年出版的《The Red Listof Rhododendrons》中，将荔波杜鹃列为极危（CR）等级，《中国生物多样性红色名录——高等植物卷（2013年）》中也将其列为极危等级。

目前，组培快繁已成为中药材、花卉、濒危物种苗木生产的重要手段。据研究报道杜鹃花科植物对培养基的适应性与其基因型密切相关，不同品种的杜鹃对培养基的适应程度不同。对于杜鹃花科植物，目前已经报道适合组织培养使用的基本培养基有Read，WPM，1/2MS，1/4MS等，但由于杜鹃花科植物种类丰富、种间差异较大，应用时还需结合不同的杜鹃花亚属甚至亚组进行元素调整。

迄今，荔波杜鹃没有相关生物技术方法繁殖的研究与报道，为了使荔波杜鹃能免于走向灭绝的危险，解决荔波杜鹃自然匮乏、种子萌发率低、引种驯化难、濒危情况严重的问题，以更大的量和更快的速度提供大量的回归小苗，实行抢救性的保护，需要研究该种的组织培养，并形成一套专门的组织培养繁殖技术体系。

发明内容

本发明的目的是提供荔波杜鹃的组织培养方法，在极度濒危的情况下实施抢救性的保护，加快种苗繁殖，提供大量的回归小苗提供切实有效的方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：

改良的WPM培养基的制备：改良WPM培养基是将原培养基中NH₄NO₃400mg/L减少为330mg/L，原培养基中KNO₃由990mg/L减少为780 mg/L，其余元素保持不变。

一种荔波杜鹃的组培繁殖方法，包括外植体的选择、消毒、愈伤组织诱导、分化、壮苗及生根步骤，取荔波杜鹃的开花后的当年新发嫩茎段为外植体，消毒先在自来水下冲洗30s，然后再用3ml洗洁精定容于1L水溶液中进行浸泡清洗3-5min，后用清水冲洗干净，用无菌水冲洗至无泡沫后转移至超净工作台，用75%的酒精消毒20s，无菌水冲洗3-5遍后，用0.1%升汞溶液（0.1g升汞固体溶解后定容至100ml水中）进行表面消毒8-12min，无菌水冲洗3-5遍后，进行如下培养：

1）愈伤组织诱导：愈伤诱导培养基为改良WPM +1.5mg/L 2-iP（2-异戊烯腺嘌呤）+0.5mg/L 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸） +1.0mg/L IAA（吲哚乙酸），pH5.8，蔗糖30g/L，1800强度的琼脂7g/L， pH5.8，暗培养7天后进行光照培养30-40天，光暗周期为10h/14h；

2）分化培养：将上述培养基中的愈伤组织转移至改良WPM +0.8mg/l 2-iP +0.1mg/L IAA+0.1mg/L IBA（吲哚丁酸），蔗糖30g/L，1800强度的琼脂7g/L，pH5.8，分化培养30 -40天，光暗周期为12h/12h；