[发明专利]腺相关病毒的纯化方法和洗脱液

说明书

本发明涉及腺相关病毒(AAV)的纯化方法和亲和柱洗脱液、由该纯化方法获得的AAV及其应用。本发明的亲和柱洗脱液包含精氨酸和镁离子。本发明的纯化方法不仅提高了AAV的产量，还改变了AAV的靶器官递送能力，提高了AAV的肝脏转导特异性。

技术领域

本公开涉及腺相关病毒(AAV)的纯化方法和亲和柱洗脱液、由该纯化方法获得的AAV及其应用。

背景技术

近年来，腺相关病毒(AAV)载体在基因治疗中的应用引起了极大的关注。然而，野生型AAV血清型(例如AAV2、AAV5、AAV8和AAV9)由于组织特异性不佳，会感染哺乳动物的多个组织/器官。为了改善AAV的器官和组织靶向性，我们已构建了一种具有视网膜和肌肉高亲和性的血清型突变体AAVz2(图1A和图1B，SEQ ID NO：1，描述于CN 113121652 A)。此外，利用AAV载体进行的肝脏靶向基因治疗，已在A型血友病和B型血友病的多项临床试验中取得了令人瞩目的成功(参考文献1)。在这些情况下，中等剂量的AAV给药足以安全地恢复血液凝固。然而，将AAV更广泛地应用于其他疾病可能需要更高效的肝细胞基因递送能力和更少的组织/器官脱靶转导。因此，开发具有优异肝细胞靶向性的AAV血清型是一个有前景的方向。

此外，针对AAV病毒的预先存在的中和抗体(Nab)也是其应用在更广泛的人群中的最大障碍之一。循环中的Nab能够屏蔽暴露在衣壳蛋白表面的受体结合位点并阻断AAV进入靶细胞或通过免疫系统加速AAV的耗竭，使AAV载体的治疗效果无效。尽管已有报道在原代人类肝细胞和人类肝细胞的异种移植小鼠模型中，工程化AAV病毒已经改善了肝脏转导，但预先存在的Nab显著降低了这些AAV血清型的活性(参考文献2)。

目前已开发了许多AAV的纯化方法，其中亲和层析、离子交换层析和分子排阻层析等层析技术已广泛应用于各种血清型AAV载体的分离纯化。在亲和层析中，洗脱条件如洗脱液的选择对于AAV的纯化至关重要。

参考文献：

1.Leebeek FWG,Miesbach W.Gene therapy for hemophilia:A review onclinical benefit,limitations,and remaining issues.Blood.2021；138:923-931

2.Perocheau DP,Cunningham S,Lee J,Antinao Diaz J,Waddington SN,Gilmour K,Eaglestone S,Lisowski L,Thrasher AJ,Alexander IE,Gissen P,BaruteauJ.Age-related seroprevalence of antibodies against aav-lk03 in a ukpopulation cohort.Human gene therapy.2019；30:79-87

发明内容

发明人出乎意料地发现，在AAV的纯化中，通过在亲和柱洗脱液中添加一定浓度的精氨酸和镁离子，不仅可以提高AAV的产量，还可以改变AAV的靶器官递送能力，提高AAV的肝脏靶向性。

因此，在第一方面，本公开提供一种纯化腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：(a)将含有AAV的溶液加样到亲和层析柱上；(b)用包含精氨酸和镁离子的第一洗脱液从亲和层析柱上洗脱AAV，收集含AAV的洗脱液；以及(c)对步骤(b)获得的含AAV的洗脱液进行超速离心。

在一个实施方式中，与用不含精氨酸和镁离子的洗脱液进行洗脱步骤的方法相比，本公开的方法使AAV的产量提高约10％、约20％、约30％、约40％，甚至约50％或更高。

在一个实施方式中，在第一洗脱液中，精氨酸的浓度为200mM至2000mM，优选400mM至1000mM，更优选500mM至800mM；和/或镁离子的浓度为0.5mM至3mM，优选1mM至3mM，更优选1.5mM至2.5mM。