[发明专利]一种棉酚降解酶CCE001a基因、氨基酸序列及其应用

权利要求书

1.一种棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因，其特征在于：其基因的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因在棉酚降解中的应用。

3.一种棉铃虫羧酸酯酶CCE001a，其特征在于：其氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其理论分子量为68.7kD。

4.一种具有棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因的重组载体，其特征在于：所述载体为pPICZαA质粒载体，所述基因表达重组载体为pPICZαA-CCE001a-2A-αsignalfactor重组载体。

5.一种具有棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因重组载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1、获得棉铃虫CCE001a基因的CDS编码区序列，标记其起始密码子编码序列ATG和终止密码子编码序列TGA；

S2、选取包含CDS区的一段碱基序列，设计引物；

所设计的引物为：

5'-ATGT CAGACAGCGCACAGGACG-3'

5'-ACTCCATACATCTGCT GAATAT-3'

S3、根据引物，以棉铃虫cDNA为模板扩增CPR和CYP9目的基因连接T-载体；

S4、以pPICZαA为模板扩增2A-Sig片段，以步骤S3中构建的T-载体为模板，高保真PCR酶扩增含连接片段同源臂的CPR和CYP9A12目的基因片段；

S5、将单酶切线性化后的pPICZaA质粒和步骤S4获得的目的基因片段，以GibsonAssembly等温连接法一次性构建pPICZαA-CCE001a基因共表达重组载体。

6.一种具有CCE001a基因共表达重组载体转化宿主细胞所得到的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的一种重组菌株，其特征在于：所述宿主细胞为毕赤酵母感受态细胞。

8.一种具有CCE001a基因共表达重组载体的重组菌株制备方法，其特征在于：首先将线性化的PpICZαA-CCE001a基因表达重组载体电击转入毕赤酵母感受态细胞后，以梯度浓度博来霉素-YPDS培养基筛选阳性菌落，通过MDH和MMH平板培养基对重组毕赤酵母菌进行Mut+和Muts菌株基因型鉴定；提取酵母基因组进行PCR鉴定重组菌；

挑取Mut+单克隆菌斑，以BMGY甘油生长复合培养基进行扩培，以BMMY甲醇诱导生长复合培养基进行诱导表达，取不同时间点细胞表达蛋白进行SDS-PAGE和WesternBlot检测。

9.一种如权利要求5所述的PpICZαA-CCE001a表达重组载体表达的棉酚降解酶。

10.一种具有如权利要求9所述的棉酚降解酶在制备酶制剂、食品、饲料或生物燃料中的应用。