[发明专利]一种腈水合酶重组蛋白的构建方法及其应用

说明书

本发明属于绿色化学技术领域，提供了一种腈水合酶重组蛋白的构建方法及其应用。本发明在腈水合酶重组质粒中插入一种G蛋白B1免疫球蛋白结合结构域(GB1)基因和一段柔性肽基因，从而表达出一种新型腈水合酶重组蛋白。与改造前相比，极大地促进了腈水合酶的可溶性表达，并显著提高了催化二腈类化合物转化效率，为生物催化腈类化合物的工业化应用提供了新的理论依据。

技术领域

本发明属于绿色化学技术领域，涉及一种通过融合蛋白提高腈水合酶催化二腈化合物生物转化效率的方法。

背景技术

大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性菌，通常，在实验室中可获取的大肠杆菌都具备清晰明确的遗传背景和十分强的环境适应力，同时也具有很强的代谢、繁殖能力，可以短时、高效地表达通过基因工程手段导入的基因，并分泌人们所需的表达产物，因此常被用作为基因工程的宿主细菌。但在实际试验、生产的过程中，除了产生所需的正常蛋白质产物外，大肠杆菌还会产生许多不溶性的蛋白即包涵体。包涵体是一种通常产生于大肠杆菌胞质中的极为紧密的蛋白聚集体。当使用大肠杆菌作为外源表达系统来表达外源重组蛋白时，如果蛋白的生成速率大于折叠速率，胞质中蛋白累积浓度过高，生成的肽链没有足够的时间折叠成为正确的天然形式，就会导致蛋白聚集形成包涵体并沉淀。根据外源重组蛋白种类、性质、表达速率和表达水平的不同，生成包涵体的产量也有所不同。同时，由于大肠杆菌中含有还原型谷胱甘肽，对重组蛋白二硫键的形成不利，更容易导致包涵体的形成。当外源重组蛋白大量形成包涵体时，将会失去原有的天然结构，从而导致其功能丧失。包涵体的产生大大影响了目的基因表达产物的产率，并造成了极大的浪费。近年来，相当多的研究致力于减少包涵体的产生，但是依然没有得到完美的解决。

腈水合酶(EC4.2.1.84，Nitrile Hydratase,简称NHase)，是腈转化酶中的一种酶，因其可以将腈类化合物催化转化为具有高附加值的酰胺类化合物，近年来引起了人们广泛的关注。利用腈水合酶生成的丙烯酰胺、烟酰胺等酰胺类化合物也被广泛应用于化工、医药、农药等领域。在众多高附加值的酰胺类化合物之中，5-氰基戊酰胺是一种重要的的化工原料和农药中间体，可用于合成除草剂唑啶草酮(azafenidin)和6-氨基己酰胺。唑啶草酮有良好的耐低温和耐雨水冲刷效应，可在冬前气温降到很低时用药，也可在降雨频繁的春季抢在雨天间隙及时用药，因其在土壤中的半衰期仅为几个小时，故对下茬作物安全，是麦田春季化除的优良除草剂。6-氨基己酰胺是合成己内酰胺的重要中间体，己内酰胺是一种常用的有机化工原料。由于5-氰基戊酰胺作为己二腈转化为己二酰二胺的中间反应物，在工业催化中难以合成，需要高温高压等严苛条件，不仅成本高也导致了更多污染物的排放；同时传统工业催化选择性差，反应伴随着大量的副产物生成，相较之下腈水合酶作为生物催化剂，具备反应温和高效、选择性优异、绿色无污染的优势，具有良好的应用前景。

目前已知的腈水合酶菌种主要包括红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等这些菌大多来源于工厂附近的污泥及废水之中，其生长条件苛刻且难以筛选、不易培养，因此将其基因转入基因工程菌内进行表达已成为人们当下热门的研究方向之一。本发明在研究前期，发现了一种腈水合酶基因并制备了腈水合酶基因工程菌，发现其有显著的区域选择性。然而发现在使用大肠杆菌作为外源表达系统来表达外源重组腈水合酶蛋白时会产生大量不溶的包涵体，降低了腈水合酶的正确表达。

G蛋白B1免疫球蛋白结构域(GB1)，是所属于G蛋白的一种小蛋白，由一个稳定的单一结构域组成，具有良好的折叠能力和稳定性。这种小蛋白没有二硫化物和辅助因子，却具有良好的高温耐受性，序列简约的特点，可以帮助重组蛋白正确折叠、促进部分蛋白可溶性表达的作用，但目前尚未发现该蛋白对于促进Fe型腈水合酶可溶性表达的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种G蛋白B1免疫球蛋白结合结构域(GB1)在促进腈水合酶重组蛋白的可溶性表达和提高二腈化合物催化效率方面的应用。