[发明专利]一种耐碱果胶裂解酶及应用

说明书

本发明提供了一种耐碱果胶裂解酶及应用，具体为一种突变果胶裂解酶PGLA4‑C209‑289编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；一种突变果胶裂解酶PGLA4‑C10‑182编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示；本发明提供的突变果胶裂解酶耐碱能力，在制浆、造纸、纺织、饲料等领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种耐碱果胶裂解酶及应用。

背景技术

果胶是由半乳糖醛酸通过α-1，4糖苷键连接而成的多聚物，是一种杂多糖，呈弱酸性，耐热性强。目前，普遍认为果胶分子包括鼠李半乳糖醛酸聚糖-I(RGI)、鼠李半乳糖醛酸聚糖-II(RGII)和多聚半乳糖醛酸聚糖(HG)3种类型。果胶酶是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，按照酶的作用方式，果胶酶可分为原果胶酶(Protopectinase)、果胶酯酶(Pectinesterase)和解聚酶(Depolymerizing enzymes)，解聚酶又包括水解酶和裂解酶，广泛存在于动、植物和微生物中。

果胶裂解酶是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶。果胶裂解酶通过切断果胶C-4位置，并从C-5处消去一个H原子，产生一个不饱和产物裂解果胶。根据其对酸碱环境的耐受度，果胶裂解酶分为碱性、中性和酸性。

中国专利文献CN113549608A(申请号：202110563930.8)公开了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用。该果胶裂解酶突变体ΔPelG403柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸；该发明提供的突变酶在碱性条件下，酶活力与耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题。该发明涉及的定点突变与本发明涉及的果胶裂解酶突变不同。

在现有技术的研究中，研究者们往往为了提高某一蛋白质的耐热性，就会在其基因结构中加入二硫键，以达到提高耐热性的效果。中国文献《二硫键对提高木聚糖AoXyn11A热稳定性的作用》(刘晓彤，邬敏辰等，食品与生物技术学报2014年第33卷第10期)中记载了利用定点突变技术在AoXyn11A的相应位置引入二硫键(Cys108-Cys152)，该研究表明二硫键对提高AoXyn11A的热稳定性有重要作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种构建耐碱果胶裂解酶的方法。

发明人发现分别将果胶裂解酶基因PGLA4的氨基酸突变为半胱氨酸，从而形成二硫键，并未提高果胶裂解酶的热稳定性，本发明改造后的果胶裂解酶PGLA4-C209-289、果胶裂解酶PGLA4-C10-182耐碱能力稳定性提高。

本发明技术方案如下：

一种突变果胶裂解酶PGLA4-C209-289编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种突变果胶裂解酶PGLA4-C209-289的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶PGLA4-C209-289编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶PGLA4-C209-289编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

一种含突变果胶裂解酶PGLA4-C209-289基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将合成的pET-28a(+)-PGLA4质粒通过反向PCR扩增含有两个突变点的C209-289基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)通过反向PCR扩增pET-28a(+)-PGLA4基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；