[发明专利]一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法

说明书

本发明提供了一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，包括以下步骤：将酶解透明质酸寡糖液体样品灭活，离心去除大分子，取滤过液，稀释后作为待测液；将所述待测液采用高效液相色谱法进行分离检测；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为乙腈；流动相B为四丁基氢氧化铵‑磷酸混合水溶液；四丁基氢氧化铵‑磷酸的摩尔比为(5～25):(4～20)，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈为流动相A，四丁基氢氧化铵‑磷酸混合水溶液为流动相B进行梯度洗脱。该方法能够针对不同酶解机制的透明质酸寡糖混合物进行分离检测，分离度高，重复性好。

技术领域

本发明属于液相色谱检测技术领域，尤其涉及一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronan，HA)又称玻尿酸(Hyaluronic acid)，广泛存在于动物组织、细胞间质中，是由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸双糖(GlcUA)单位通过β-1,4糖苷键连接，并以β-1,3糖苷键连接形成的无支链双糖重复单元的黏性多糖。透明质酸广泛应用于食品、化妆品、医药、保健品等领域。透明质酸寡糖(o-HAs)是指由HA降解形成，相对分子质量小于10k的寡聚糖。o-HAs的制备方式有多种，其中酶切法因为专一高效、条件温和、易控制和产物相对单一的特点而被广泛使用，酶切法由于水解机制的不同可以分为三类：

专利CN113801904A及专利CN113876623A均报道了一种透明质酸寡糖分布的液相检测方法，该专利的检测方法为：色谱柱：SUPERDEX 200 10/300GL；柱温：40℃；检测器：紫外-可见分光检测器；流动相：1mol/L硫酸铵溶液；进样浓度：0.5％；进样量：20μL；流速：2ml/min；检测波长：200nm。从其结果可知，透明质酸寡糖没有完全分离，分离度不够，且专利中的色谱柱为非常规色谱柱，成本较高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，该方法分离度较高、重复性好。

本发明提供了一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法，包括以下步骤：

将酶解透明质酸寡糖液体样品灭活，离心去除大分子，取滤过液，稀释后作为待测液；

将所述待测液采用高效液相色谱法进行分离检测；

所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈；流动相B为四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液；四丁基氢氧化铵-磷酸的摩尔比为(5～25):(4～20)，梯度洗脱。

在本发明中，所述流动相B四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液中四丁基氢氧化铵的浓度为10mmol/L、磷酸的浓度为8mmol/L。

在本发明中，所述四丁基氢氧化铵-磷酸混合水溶液的pH值为6.0～7.5，优选为7.00±0.02。

在本发明中，采用agilent Poroshell120EC-C18色谱柱(3.0×150mm，2.7μm)，柱温为30℃；平衡时间为28～32h，优选为24h。

在本发明中，流动相A和流动相B的体积比为(25～50):(75～50)，优选为50:50；

流动相的流速为0.5mL/min；

检测波长为双波长，分别为210nm和232nm；

进样量为5μL。

在本发明中，所述酶解透明质酸寡糖液体样品选自牛睾丸型BTH酶酶解透明质酸寡糖液体、水蛭型LHase酶酶解透明质酸寡糖液体、细菌型MHase酶酶解透明质酸寡糖液体、高温加热的透明质酸寡糖水解液、或微生物滋生后透明质酸寡糖液体。