[发明专利]一种聚合物修饰抗体类药物的修饰度的测定方法

说明书

本发明公开了一种聚合物修饰抗体类药物的修饰度的测定方法，特别是PEG修饰单克隆抗体的修饰度的测定方法。通过该测定方法，利用LC‑Q‑TOF来计算单抗链上的聚合物(例如PEG)修饰度，无需将不同修饰度的单抗链进行完全的物理分离或色谱分离，利用解卷积出的分子量差值规律，可同时得到轻链和重链上的聚合物(例如PEG)修饰度；而且，无需物理分离，用MALDI‑TOF对高达十几万的聚合物修饰抗体进行分子量检测，也可以对还原拆分后的轻链和重链进行分子量检测，计算出聚合物(例如PEG)修饰度；LC‑Q‑TOF与MALDI‑TOF联合使用，互为补充，互相验证，可以得到重链和轻链更多的修饰信息，使结果更加可靠。

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种聚合物修饰抗体类药物(特别是PEG修饰单克隆抗体)的修饰度的测定方法及其应用。

背景技术

蛋白质类药物主要包括多肽、酶、细胞因子、激素、抗体等一些具有特殊功能的蛋白质，随着生物技术的发展，人们可以通过发酵工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程等途径获得所需的蛋白质。但经过大量的临床研究发现，未经任何修饰的蛋白类药物在体内具有半衰期短、免疫原性强、稳定性差、易被体内酶降解等缺陷，从而降低了临床效果。为此，人们尝试通过多种途径对蛋白类药进行改造以适应于临床应用。

聚乙二醇(PEG)是一种在溶液中可自由卷曲的不带电荷的水溶性聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，用其共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。近年来，PEG还作为连接子用于抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADC，其由抗体(antibody)、药物(Drug)以及连接子(linker)三部分组成)的制备。抗体药物偶联物因其良好的靶向性及抗肿瘤活性，可实现“精准治疗”，已成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点和重要趋势，受到越来越多的关注。

由于蛋白质上可以发生修饰的位点较多，因此，反映PEG对蛋白质修饰程度的平均修饰度或PEG结合数，对该类药物构效关系研究与质量控制具有重要意义。目前，PEG平均修饰度的检测方法主要有：三硝基苯磺酸(TTBS)法、荧光胺法、质谱法、液相色谱法、毛细管法、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼散射光谱、酶解法等。在实际应用中发现TTBS法和荧光胺法简单易操作，但受外界干扰大，造成较大的实验误差，例如专利文献CN108267590A的比较例中所述。CN108267590A公开了一种PEG修饰蛋白的PEG结合数检测方法，其采用酶解法将待测PEG修饰蛋白样品处理后将PEG释放出来，检测PEG的质量，通过蛋白及PEG的摩尔比推算出PEG修饰蛋白中PEG结合数。但酶解法中有可能释放PEG不完全，为避免游离PEG干扰，往往还需要对酶解样品进行纯化。专利文献CN109682901A公开了一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，其包括使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线的步骤，步骤较为繁琐，实际检测中工作量较大。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种聚合物修饰蛋白类药物(特别是PEG修饰单克隆抗体)的修饰度的测定方法及其应用。

在本发明第一方面，提供一种聚合物修饰抗体的修饰度的测定方法，其包括将待测样品通过MALDI-TOF检测、将待测样品经还原剂处理后分别通过LC-Q-TOF和MALDI-TOF检测的步骤。

具体地，将待测样品经还原剂处理后分别通过LC-Q-TOF和MALDI-TOF检测的步骤包括：

(1)将待测样品与还原剂混合，进行还原反应；