[发明专利]重组腈水解酶的生产及固定化方法及其对乙腈的降解应用

说明书

本发明公开了一种重组腈水解酶的生产及固定化方法及其对乙腈的降解应用，涉及环境生物技术领域，该酶水解酶融合多肽为高温腈水解酶突变后，与纤维素结合域共整合后生成的新型工业酶，可以特异结合到木浆纤维素，实现酶的固定化及高效特异的污染物降解。本发明公布了表达该多肽的重组表达系统，包括重组载体、表达宿主、以及纤维素结合域以及连接肽段的序列，以及用于重组多肽表达的分泌肽序列。枯草芽孢杆菌重组表达的腈水解酶融合蛋白经一步法固定到木浆纤维素，提高酶催化的稳定性，实现对流动污水中乙腈的生物去除。

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种重组腈水解酶的生产及固定及其对乙腈的降解应用。

背景技术

乙腈是丙烯腈生产的副产物，丙烯腈是一种重要的化工原料，它是合成人工羊毛、丁基橡胶及合成树脂的化学单体，还可以生产丙烯酰胺和丙烯酸等化学品，每年我国的丙烯腈的原料生产量巨大。乙腈自身也是一种的工业原料，可以用于生产有机腈类农药、维生素B1等化合物，也是丁二烯及芳烃等化工产品的抽提溶剂，近年来，乙腈也被大量用于甲硝羟乙唑等医药产品的合成原料或溶剂。随着乙腈在现代工业中的大量应用，一些工业园区的水体环境中可检测到超标的乙腈污染。

常温常压下乙腈是一种带甜味的有机液体，与水的互溶性非常好，也是很多有机物的溶剂，因此是有机物分析色谱中最常用的溶剂。但其具有一定的生物毒性，尤其是在生命体中，可由细胞内的酶降解产生无机氰离子，带来更大的毒性，因此污染水体中乙腈的排放控制十分严格，一般在5.0毫克每升以下。乙腈化学性能较为活泼，但是非特异性的降解或转化通常不能解除这类有机腈化合物带来的生物毒性。高浓度的乙腈污染可以通过吸附、臭氧氧化或加入高浓度碱液进行处理，但是在污染物浓度为克每升以下时，这类物理化学处理方法不仅使用成本高，而且还会带来新的污染物，例如，臭氧处理后会生成氰酸盐，其毒性下降，但并没有彻底降解为无害物。

许多微生物，如假单胞菌、玫瑰红球菌等均可在水体中对乙腈进行降解利用，这些微生物作为降解低浓度乙腈等有机腈化物的高效生物降解系统虽已被研究多年，但受活体微生物个体在污水系统中的存活率影响，该生物催化方法的持久性及其效率依然无法满足实际污染处理应用的需求。腈水解酶可见于自然界的各种生命体中，如真菌、细菌及植物细胞中，腈水解酶作为一种重要的工业酶，可以降解无机氰化物，也能将将有毒腈化物催化为有机酸和氨，因此，腈水解酶在氨基酸、维生素等化工产品或医药中间体的生物合成中具有重要的用途。但是为了更好的工业应用，腈水解的酶学性能往往需要进行工程改造或诱变训化。此外，由于游离酶对底物的敏感性，针对腈水解酶进行固定化，也是提高该酶催化稳定性，延长酶的使用周期，降解使用成本的关键技术之一。

酶的固定化技术按照固定方式分吸附、包埋、交联、耦合等方式，利用酶对天然材料的吸附是其中固定成本最低的方式之一。纤维素酶往往带有一段可以识别并结合纤维素的结构域，该多肽可以帮助其它蛋白对纤维素进行结合。在纤维素结合域与催化蛋白之间往往需要设计连接肽，使纤维素结合与酶的催化功能不受彼此干扰，由于酶的催化性能及特异性的不同，连接肽的序列及长度均需要进行优化及实验验证。

发明内容

为了能够利用腈水解酶，实现对污染水体中乙腈等有机腈污染物的生物处理，本发明公开了一种编码腈水解酶的融合蛋白的DNA及其多肽序列，以及用于重组生产该重组酶的实验方法；本发明还公开了一种基于纤维素特异性结合的生物固定方法，并提供了利用该纤维素固定系统开展乙腈降解的应用方法，该重组酶及其固定方法的应用可以极大地提升腈水解酶对水体中乙腈污染物的降解效率。

为了实现上述目的以及其它相关目的，本发明采用如下技术方案：