[发明专利]AP质粒及其应用、PAP I酶的PACE定向进化系统及PAP I酶突变体

说明书

本发明提供一种AP质粒，其特征为：所述质粒表达gIII‑neg蛋白，且在其核糖体结合位点后部插入了一个或多个SEQ ID No.1所示的RyhB结合序列。还公开了其在PAP I酶的PACE定向进化中的应用及PAP I酶的PACE定向进化系统。并公开了筛选得到的PAP I酶突变体、编码基因、原核表达载体及原核表达系统。本发明在PACE定向进化方法中引入了大肠杆菌非编码RNA RyhB sRNA，抑制gIII‑neg蛋白的翻译，解除gIII‑neg蛋白对子代噬菌体包装的不利影响。聚腺苷化活性越强的PAP I，越能延长RyhB的半衰期，促进后者对gIII‑neg蛋白的翻译抑制作用。噬菌体在多次传代后形成种群优势并被分离测序，最终获得活力显著提升的PAP I。

技术领域

本发明专利涉及一种AP质粒及其应用、PAP I酶的PACE定向进化系统及PAP I酶突变体、编码基因、原核表达载体和原核表达系统，属于生物技术领域。

背景技术

PAP I为大肠杆菌Poly(A)聚合酶I(Poly(A)polymerase I)，负责RNA分子3’端聚腺苷化，可作用于胞内绝大多数mRNA转录本进而降低mRNA的半衰期。PAP I存在明显的细胞毒性，因此细胞内的PAP I水平与细胞的生长速率成反比，过量的PAP I会导致细菌生长缓慢。这种毒性是由于PAP I会将成熟的tRNA的3’末端聚腺苷化，从而妨碍酰胺基-tRNA合成酶的酰胺基化，最终影响蛋白质的合成和细胞生长。正因为上述原因，过表达PAP I的细胞通常生长缓慢，并且PAP I的表达水平较低。鉴于PAP I为模板非依赖型RNA聚合酶，它可被用于体外RNA加尾实验，一方面可以稳定RNA，另一方面可为反转录提供接头结合区域。

除了影响mRNA和tRNA，PAP I也被报道可作用于sRNA的3’末端，延长sRNA的半衰期。sRNA是细菌表达的一类非编码RNA，长度范围通常在20nt-400nt之间，依赖局部碱基的互补配对调节靶mRNA的翻译。大多数情况下，sRNA的作用需要Hfq蛋白的参与，以提升sRNA的稳定性或sRNA与mRNA结合的亲和力。由于特定二级结构的存在，同一sRNA与不同靶点的结合区域序列存在一定的保守性。根据Dhriti Sinha的报道，PAP I对大肠杆菌RyhB sRNA的稳定和功能发挥有重要作用。RyhB的聚腺苷化可显著提升稳定性，进而促进其与靶点的作用，加速部分靶mRNA的降解使翻译流产。

PACE是一种依赖于噬菌体快速繁殖而实现蛋白定向进化的系统，与目标蛋白酶学性能相偶联的噬菌体包装蛋白gIII的表达水平越高，子代噬菌体的丰度越高。在体内诱变系统的作用下，伴随着噬菌体传代目标突变体的DNA序列即子代噬菌体被富集。PACE的负筛选体系则取决于功能缺陷的gIII-neg的蛋白浓度，gIII-neg浓度越低，子代噬菌体越容易繁殖。该策略与sRNA的翻译负调节作用可实现兼容，用于搭建一套独特的蛋白进化系统。考虑到PAP I可用于体外RNA修饰，但野生型PAP I不够理想，这一种进化体系可用于提高PAPI的酶学性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性重组热敏型UDG突变体，相比野生型UDG，其热失活温度明显降低。

本发明提供了一种AP质粒，其特征为：所述质粒表达gIII-neg蛋白，且在其核糖体结合位点后部插入了一个或多个SEQ ID No.1所示的RyhB结合序列，AP质粒中RyhB-gIII-neg的序列可以如SEQ ID No.5所示。

本发明还公开了上述的AP质粒在PAP I酶的PACE定向进化中的应用。

本发明还公开了一种PAP I酶的PACE定向进化系统，其特征在于包括：上述的AP质粒、DP质粒和SP质粒、宿主菌，所述DP质粒携带野生型gIII基因和野生型PAP I表达基因，所述SP质粒为M13噬菌体基因组，其中gIII基因被野生型PAP I表达基因取代。

优选的，所述AP质粒和DP质粒含有不同的抗性基因，其中DP含氯霉素抗性基因，AP为羧苄青霉素抗性基因。