[发明专利]动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法

说明书

本申请具体公开了一种动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法。动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法包括以下步骤：取动物脐带组织并对脐带间充质干细胞进行培养；外泌体的提取：使用完全培养基培养P3～P20代脐带间充质干细胞，收集上清液，对上清液进行离心去除死细胞和细胞碎片，过滤去除微粒，然后对上清液使用离心法沉淀外泌体；对外泌体沉淀使用PBS重悬后置于‑70～‑80℃环境下保存。本申请的提取方法具有操作简便，外泌体产量高的优点。

技术领域

本申请涉及细胞技术领域，更具体地说，它涉及动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法。

背景技术

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡,直径在30-150nm之间，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，外泌体含有其来源细胞的胞膜和胞质蛋白成分，因此它较易与邻近细胞的胞膜发生融合，进而将一个细胞的胞膜及胞质蛋白传递给另一个细胞，在不同细胞间进行信息传递。此外泌体还包含着能够在细胞间进行转移的RNA(mRNA及microRNAs)，通过在细胞间水平转移方式激活靶细胞产生一系列生物学效应。因此，外泌体在细胞微环境中具有十分重要的作用。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和多向分化能力的细胞，研究发现间充质干细胞分泌的外泌体中含有丙酮酸激酶、人乳脂肪球EGF因子蛋白、跨膜四蛋白等多种蛋白质，他们在参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织的修复与再生方面产生着重要作用。

然而目前通过脐带间充质干细胞提取外泌体的产量低，从而阻碍了外泌体的大规模应用。

发明内容

为了提高了通过脐带间充质干细胞提取外泌体的产量，本申请提供动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法。

第一方面，本申请提供动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，采用如下的技术方案：

动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

取动物脐带组织并对脐带间充质干细胞进行培养；

外泌体的提取：使用完全培养基培养P3～P20代脐带间充质干细胞，收集上清液，对上清液进行离心去除死细胞和细胞碎片，过滤去除微粒，然后对上清液使用离心法沉淀外泌体；对外泌体沉淀使用PBS重悬后置于-70～-80℃环境下保存。

优选的，取动物脐带组织并对脐带间充质干细胞进行培养包括以下步骤：

S1动物脐带组织的处理，剔除脐带组织中膜组织和血管组织，

S2将经过处理后的脐带组织转移至离心管中，加入胶原酶35～37℃下处理3～6h；

S3将经过S2处理后的组织液过滤，滤液经离心后得到沉淀部分；

S4沉淀部分用完全培养基重悬，重悬液接种至细胞培养皿中培养24h；

S5使用PBS缓冲液清洗培养细胞，并更换新鲜培养基；

S6每隔36～48h重复步骤S5；

S7当细胞铺满培养皿70-80％，对细胞进行传代培养。

在本申请的一些实施方案中，动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

(1)取羊脐带组织并对脐带间充质干细胞进行培养：

S1动物脐带组织的处理，剔除脐带组织中膜组织和血管组织，剩余的胶质组织剪至1mm²；S2将经过处理后的脐带组织转移至离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，35～37℃下处理3～6h；S3将经过S2处理后的组织液用100目细胞筛过滤，滤液经1200r/min离心5min，离心后得到沉淀部分；

S4沉淀部分用完全培养基重悬，重悬液接种至细胞培养皿中培养24h；

S5使用PBS缓冲液清洗培养细胞，并更换新鲜的完全培养基；

S6每隔36～48h重复步骤S5；