[发明专利]动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法

权利要求书

1.动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

取动物脐带组织并对脐带间充质干细胞进行培养；

外泌体的提取：使用完全培养基培养P3～P20代脐带间充质干细胞，收集上清液，对上清液进行离心去除死细胞和细胞碎片，过滤去除微粒，然后对上清液使用离心法沉淀外泌体；

对外泌体沉淀使用PBS重悬后置于-70～-80℃环境下保存。

2.根据权利要求1所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述取动物脐带组织并对脐带间充质干细胞进行培养，具体包括以下步骤：

S1动物脐带组织的处理，剔除脐带组织中膜组织和血管组织，

S2将经过处理后的脐带组织转移至离心管中，加入胶原酶35～37℃下处理3～6h；

S3将经过S2处理后的组织液过滤，滤液经离心后得到沉淀部分；

S4沉淀部分用完全培养基重悬，重悬液接种至细胞培养皿中培养24h；

S5使用PBS缓冲液清洗培养细胞，并更换新鲜培养基；

S6每隔36～48h重复步骤S5；

S7当细胞铺满培养皿70-80%，对细胞进行传代培养。

3.根据权利要求1或2所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述完全培养基，按重量百分比计，包括基础培养基80-90%、无外泌体胎牛血清8%～12%、双抗溶液0.5%～1.5%、维生素 C 0.1～0.4%、L-谷氨酰胺1.5%～3%、转铁蛋白0.01～0.05%、硝酸铁0.1～0.18%。

4.根据权利要求3所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述转铁蛋白与所述硝酸铁用量比为1:（2～6）。

5.根据权利要求4所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，按重量百分比计，所述完全培养基包括基础培养基80-86.65%、无外泌体胎牛血清10%、双抗溶液1%、维生素C 0.2%、L-谷氨酰胺2%、转铁蛋白0.03%、硝酸铁0.12%。

6.根据权利要求4所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

7.根据权利要求1所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，使用完全培养基培养P3～P20代脐带间充质干细胞时，还包括电刺激培养，对脐带间充质干细胞进行交流电刺激，电场强度为100～500mv/cm，频率为5～20HZ。

8.根据权利要求7所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述电场强度为200～400mv/cm，所述频率为10～20HZ。

9.根据权利要求7所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，交流电刺激时交流电的波形为双向方形。

10.根据权利要求1所述的动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法，其特征在于，所述离心法包括，

4～6℃环境下，300～600 g离心10 min，收集上清液；

接着在4～6℃环境下，2 000～3 000 g离心10 min。收集上清液；

继续在4～6℃环境下， 10000～12000 g离心10 min，收集上清液；

最后再在4～6℃环境下，100000～150000g离心1.5~2.5 h，得到所述外泌体沉淀。