[发明专利]一种星油藤六倍体植株的培育方法

权利要求书

1.一种星油藤六倍体植株的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)胚乳愈伤诱导：无菌条件下，星油藤种子常规消毒处理后，去除种皮，将胚及胚乳接种在愈伤组织诱导培养基中，黑暗条件下培养30d后，剥离胚，胚乳继续培养诱导胚乳愈伤组织，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～3.0mg/L 6-BA+0.5～2.0mg/L NAA+0.5～1.0g/L水解酪蛋白+0.5～1.0g/L吗啉乙磺酸+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；

(2)原生质体游离及分选：将胚乳愈伤组织置于4℃条件下黑暗处理24h后，用愈伤组织酶解液处理5～10h游离原生质体，然后用活体DNA染色剂(5～10μg/ml Hoechst 33342)染色3～5min，在无菌条件下利用流式细胞仪筛选三倍体细胞，使其得到富集；所述的愈伤组织酶解液包括细胞壁水解酶和原生质体洗涤液，其中细胞壁水解酶为1.0～2.0％纤维素酶+0.5～1.0％离析酶+0.5～1.0％果胶酶，原生质体洗涤液为20～25mg/L KH₂PO4+90～100mg/L KNO₃+180～240mg/L MgSO₄·H₂O+0.1～0.2mg/L KI+0.01～0.02mg/L CuSO₄+1.0～1.5g/L CaCl₂·H₂O+0.5～0.8mol/L甘露醇+10～20μmol/L吗啉乙磺酸，pH为5.4～5.8；

(3)六倍体愈伤组织诱导及分选：将分选所得的三倍体原生质体置于六倍体愈伤组织诱导培养基中，黑暗条件下25℃轻柔震荡培养直至形成愈伤组织块后，将其转接至愈伤组织诱导培养中培养获得愈伤组织，并按步骤(2)进行原生质体游离，分选出六倍体原生质体；所述的六倍体愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～3.0mg/L 6-BA+0.5～2.0mg/L NAA+1.0～2.0g/L秋水仙碱+0.5～1.0g/L水解酪蛋白+0.5～1.0g/L吗啉乙磺酸+0.5～0.8mol/L甘露醇+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；

(4)六倍体原生质体培养形成愈伤组织：将分选所得的六倍体原生质体置于含有0.5～0.8mol/L甘露醇的愈伤组织诱导培养基中，黑暗条件下25℃轻柔震荡培养直至形成愈伤组织块后，将其转接至愈伤组织诱导培养中于在25℃，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1条件下培养获得愈伤组织；

(5)六倍体愈伤组织诱导形成不定芽：将愈伤组织接种于芽分化培养基中进行芽分化培养获得不定芽；所述的芽分化培养基为：MS+0.5～1.0mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；

(6)不定芽诱导生根形成六倍体幼苗：将不定芽接种于生根培养基中进行生根培养获得星油藤六倍体幼苗；所述生根培养基为1/2MS+0.1～0.5mg/L IBA+1.0～2.0mg/L GGR+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；

(7)栽培：将星油藤六倍体幼苗根部的培养清洗干净后，栽培于混合基质中栽培成苗即得星油藤六倍体种苗；所述混合基质为由比例8:1:1的泥炭土、农家肥、河沙混合而成的基质。