[发明专利]一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及晚期糖基化终末产物检测技术领域，尤其涉及一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。本发明检测血清中游离晚期糖基化终末产物的试剂盒包括洗脱液、稀释液、蛋白沉淀剂、质控品；所述蛋白沉淀剂为磺基水杨酸；本发明同时提供了一种检测血清样本中游离晚期糖基化终末产物的方法。采用本发明的检测方法及试剂盒，样品前处理更加简单、方便，仅需要一步蛋白沉淀过程，就能有效提取样本中的24种游离AGEs，同时可实现“一针进样”同时检测24种游离AGEs，单个样本检测时长为6分钟，大大缩短样本时间，通过色谱条件优化，能将生物体内存在的AGEs同分异构体实现基线分离，提高了定量的特异性和准确性。

技术领域

本发明涉及晚期糖基化终末产物检测技术领域，尤其涉及一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。

背景技术

晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是体内蛋白质、脂质或核酸类大分子暴露于还原糖中生成的一组复杂的异质性物质，是人体在非酶促条件下，体内葡萄糖或其他还原糖的醛基或酮基与蛋白质、核酸、脂质等一些大分子物质的自由氨基，在体内经过系列反应生成的不可逆终末产物。AGEs对酶稳定，不易被降解，主要通过肾脏清除，在体内随着糖尿病、衰老等发展过程不断生成和蓄积，直接或间接与细胞表面的受体结合而发挥细胞毒性作用。多种研究表明体内血清中游离AGEs的含量在某些代谢性疾病如糖尿病及其并发症，心脑血管疾病如动脉粥样硬化及阿尔茨海默症等疾病中呈现不同程度的升高，是这类疾病的预警、诊断及疗效监测标志物。因此对不同疾病状态下各种不同结构的AGEs进行精准定量，为开发疾病的早期诊断标志物及疗效检测指标具有重要意义。

血清内游离AGEs是一类氨基酸衍生型的小分子物质，根据其与氨基酸结合类型的不同可大致分为赖氨酸衍生型、精氨酸衍生型、赖氨酸-精氨酸交联衍生型、半胱氨酸衍生型及组氨酸衍生型等。游离型AGEs在血液中含量低(通常在pmol水平)、结构类似物众多，因此，对检测方法的灵敏度和特异性要求很高。目前AGEs的常用检测方法包括荧光光谱法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫荧光法(FIA)、免疫组织化学法和放射免疫分析法(RIA)、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)等。荧光光谱法在临床应用较多，但是存在只能检测到具有荧光发光基团的少数几种AGEs的缺点。ELISA法是基于抗原抗体特异性结合的检测方法。然而由于一些AGEs有相同的抗原决定簇，其抗原表位发生改变会导致检测结果假性降低，另一方面AGEs可能会与非AGEs修饰的结构发生交叉反应导致结果假性升高，同时不含该抗原表位的蛋白来源AGEs和脂类来源的AGEs不能检测。RIA存在放射性核素对人体损害较大并造成环境污染。以抗原-抗体免疫反应为基础的方法，不可避免的带来了非特异性反应的问题而使得测定结果有明显系统误差，同时各实验室使用不同生产厂家的试剂导致结果可比性差，直接影响了检测结果在疾病筛查中的可信度。HPLC法能对AGEs中特定的几种能发荧光或者紫外光的化合物进行检测，对结构及其相似的化合物不能做到全部分离，从而干扰方法的特异性。

随着质谱技术的快速发展，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)由于结合了质谱的高分辨与液相的高分离特点，对于小分子化合物的定量有着独特的优势。然而由于AGEs这类物质具有种类繁多、结构复杂、商品化的纯度标准品难以获得、化合物极性大色谱分离困难且存在多种同分异构体，关于多种血清游离AGEs同步检测的LC-MS/MS方法还未见报道。同时目前缺乏相应的质谱检测试剂盒应用于临床检测，限制了其在临床上的应用。因此，开发稳定的基于LC-MS/MS技术的检测血清游离AGEs的方法，并研制相应的检测试剂盒能够为临床提供更加准确可靠的检测方法，对推广精准医疗，提高国内代谢性相关疾病的诊断治疗水平具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。本发明采用同步检测血清中24种游离AGEs的LC-MS/MS方法检测血清中游离AGEs，具有简单、耗时显著缩短、精准定量的优点。