[发明专利]一种刺参体液样品外泌体分离的方法

说明书

本发明涉及一种刺参体液样品外泌体分离方法。针对刺参的体液样品，初步过滤后混合等渗抗凝剂进行预处理，随后利用低温中速离心、高速离心、超速离心结合多次过滤的方法，提取分离刺参中的外泌体，并利用等渗缓冲液进行重悬，用于后续实验。本发明提出的刺参外泌体分离方法稳定有效，操作简单，所提取的外泌体完整性较强、含量较多、纯度较高。

技术领域

本发明涉及外泌体提取分离的技术领域，具体为一种刺参体液样品外泌体分离的方法。

背景技术

外泌体(Exosomes,Exos)是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，是细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)的一种。2013年诺贝尔生理学或医学奖颁发给研究“细胞的囊泡运输调控机制”的三位科学家，外泌体逐渐成为国际性的研究热点。外泌体中富含各种mRNA、miRNA和蛋白等，并可在不同的细胞之间转运，被靶细胞摄取后影响靶细胞的生物学行为，是重要的细胞间转运系统。外泌体特殊的膜结构能够保护其内部的RNA免受酶的降解，因此相对于体液RNA，外泌体中各类RNA更为稳定，含量更高。因此，外泌体是研究机体内各类核酸调控机制的重要研究对象。

刺参体液主要包括体腔液及波里氏囊体液，分别存于刺参的体腔及波里氏囊体中。由于刺参缺乏特异性免疫，体液是刺参进行机体防御重要的承担者。刺参体液中包含大量的吞噬细胞、桑葚细胞等体腔细胞，且含有凝集素、穿孔素和类补体样因子等体液免疫因子，二者共同组成刺参的天然免疫防御。在刺参响应高温、低氧、低盐、酸化、病原侵害等胁迫条件时，体腔液中的细胞及免疫因子发生变化且发挥重要功能，可削弱胁迫对机体的损害作用。

刺参体液中存在丰富的体腔细胞，可以分泌大量外泌体，是刺参免疫等生理生化及分子调控研究领域重要的研究对象。外泌体的完整性对于其生物活性至关重要。然而目前市场上已有的快速提取外泌体的试剂盒大多针对哺乳类动物，并不适用于刺参等棘皮动物，且普通的离心法未考虑刺参体液渗透压特性及体液中残留的肠道及呼吸树等组织样品碎片的影响，无法保证提取样品的完整性、产量、特异性及稳定性。因此针对刺参体液样品建立一套稳定有效、操作简单且能保障膜完整性的外泌体制备方法具有重要价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种刺参体液样品外泌体提取分离的方法，以解决刺参外泌体暂无明确提取方法的问题。

本发明涉及一种刺参体液样品外泌体分离方法。针对刺参的体液样品，初步过滤后混合等渗抗凝剂进行预处理，随后利用低温中速离心、高速离心、超速离心结合多次过滤的方法，提取分离刺参中的外泌体，并利用等渗缓冲液进行重悬，用于后续实验。

一种刺参体液样品外泌体分离的方法，主要包括以下步骤：

(1)体液样品提取：

解剖刺参后收集体液样品500μL～50mL，筛绢过滤后置于离心管中；

(2)体液样品处理：

向离心管中加入等体积量的刺参等渗抗凝剂混合；通过40μm网状过滤器过滤至离心管中，进行后续提取；

(3)低温中速离心：

低温中速离心15min后，将上清转移至新的离心管中，去除滤液中的碎片；

(4)低温高速离心过滤：

将(3)中取得的上清液低温高速离心45min，得到的上清液使用无菌0.22μm过滤器进行过滤处理，去除样品中杂质及直径大于220nm以上的大颗粒囊泡；

(5)低温超高速离心：

将(4)中取得的上清液转移至无菌超高速离心管中，低温超高速离心70min；小心吸弃上清液，保留超离管底的沉淀，即为刺参外泌体沉淀；

(6)外泌体样品获取与保存：