[发明专利]一种刺参体液样品外泌体分离的方法

权利要求书

1.一种刺参体液样品外泌体分离的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（1）取刺参体液与刺参等渗抗凝剂混合，刺参体液与刺参等渗抗凝剂的体积比为1.5:1~1:1.5；通过孔径20~60μm筛网过滤，收集滤液；

刺参等渗抗凝剂pH=7.0~8.5，于水溶液中各组分浓度分别为0.015~0.03 M EGTA、0.30M~0.60 M NaCl、0.005~0.05 M KCl、0.01~0.2 M Tri-HCl；

（2）2~6℃下以300~6000 ×g的速度离心，去除滤液中的碎片，收集上清液；

（3）将步骤（2）中取得的上清液，2~6℃下以8000~20000 ×g的速度离心，得到的上清液使用孔径0.18~0.30μm筛网进行过滤处理，去除样品中杂质及大颗粒囊泡，得到上清液；

（4）将步骤（3）中取得的上清液，2~6℃下以90000~200000 ×g的速度离心；弃上清液，得到的沉淀即为刺参外泌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

用预冷至2~6℃的等渗缓冲液重悬沉淀，用于刺参外泌体的保存，等渗缓冲液的使用量为30~300 μL，对应原始刺参体液样品体积为500 μL~50 mL；

刺参等渗缓冲液pH=7.0~8.5，于水溶液中各组分浓度分别为 0.0005~0.002M EGTA、0.20~0.53 M NaCl、0.005~0.10 M Tri-HCl。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

刺参等渗缓冲液pH=7.3~8.0，于水溶液中各组分浓度分别为0.0008~0.0012 M EGTA、0.32~0.34 M NaCl、0.01~0.06 M Tri-HCl。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

其中刺参等渗抗凝剂pH=7.3~8.0，于水溶液中各组分浓度分别为0.019~0.023 MEGTA、0.32 M~0.48 M NaCl、0.01~0.03 M KCl、0.03~0.1 M Tri-HCl。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

体液样品提取过程为：解剖刺参后收集体液样品，通过孔径200~600目筛绢过滤，得体液样品；

刺参体液包括体腔液或波里氏囊体液中的一种或二种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤（2）中的离心时间为5~30 min；

步骤（3）中的离心时间为30~60 min；

步骤（4）中的离心时间为60~90 min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤（1）中取刺参体液与刺参等渗抗凝剂混合，刺参体液与刺参等渗抗凝剂的体积比为1:1~1:1.2；通过孔径35~45μm筛网过滤，收集滤液；其中，刺参等渗抗凝剂pH= 7.3~8.0；

步骤（2）中2~6℃下以1000~4000 ×g的速度离心，去除滤液中的碎片，收集上清液；其中，离心时间为10~20 min，

步骤（3）中将步骤（2）中取得的上清液，2~6℃下以10000~16500 ×g的速度离心，得到的上清液使用孔径0.21~0.24μm筛网进行过滤处理，去除样品中杂质及大颗粒囊泡，得到上清液，其中，离心时间为40~50 min；

步骤（4）中将步骤（3）中取得的上清液，2~6℃下以100000~150000 ×g的速度离心，弃上清液，得到的沉淀即为刺参外泌体，其中，离心时间为70~80 min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述等渗缓冲液的使用量为50~150 μL，对应原始刺参体液样品体积为500 μL~50 mL，等渗缓冲液pH=7.3~8.0。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，解剖刺参后收集体液样品，通过孔径250~350目筛绢过滤，得体液样品。