[发明专利]一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法

说明书

本发明一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，包括如下步骤：步骤1、使用BHK细胞悬浮法培养口蹄疫病毒；步骤2、配置口蹄疫病毒灭活剂：称取氢氧化钠与注射水混合，再依次加入β‑萘酚紫溶液和二溴乙胺氢溴酸盐，混合均匀，得到口蹄疫病毒灭活剂；步骤3、灭活前处理；步骤4、首次灭活处理；步骤5、再次灭活处理；步骤6、灭活后处理；步骤7、后续检测。本发明灭活过程可靠、灭活结果安全，且符合相关的标准。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、发热、等高度接触性传染病。成年动物的临床症状包括：体温升高，口舌部出现水泡、溃烂，蹄部出现水泡、溃烂，甚至蹄壳脱落，引起饮食困难、起卧困难，经济动物体重下降甚至丧失经济价值；幼年动物临床症状包括：体温升高、心肌炎等症状，一旦发病，幼年动物死亡率较高；乳鼠感染口蹄疫后，出现四肢麻痹、尾部麻痹、心肌炎等症状。致病因子为口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型)，其中O型口蹄疫病毒流行最为广泛。

口蹄疫病毒离线收获过程为：悬浮培养成熟的病毒分装至10L的血清瓶，放入冷库，然后再融解。经过纱布(或不锈钢滤网)粗过滤后，再用二级或者三级滤芯过滤、灭活。处理周期长、单批次处理能力弱、收率低。因此，缩短生产周期，调整口蹄疫病毒的粗提纯工艺，提高口蹄疫病毒的灭活收率成为一个亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种生产周期短、悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法。

本发明的目的采用以下技术方案来实现：

一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，包括如下步骤：

步骤1、使用BHK细胞悬浮法培养口蹄疫病毒，得到培养成熟的口蹄疫病毒悬浮培养液；

步骤2、配置口蹄疫病毒灭活剂：

称取氢氧化钠与注射水混合，再依次加入β-萘酚紫溶液和二溴乙胺氢溴酸盐，混合均匀，得到口蹄疫病毒灭活剂；

步骤3、灭活前处理：

向培养成熟的口蹄疫病毒悬浮培养液中，加入三氯甲烷，剧烈搅拌，离心过滤，得到第一混液；

步骤4、首次灭活处理：

将配制好的口蹄疫病毒灭活剂加入至第一混液中，搅拌条件下进行灭活，灭活的前4个小时，每小时取一次样，灭活24h后结束，得到第二混液；

步骤5、再次灭活处理：

再次将配制好的口蹄疫病毒灭活剂加入至第二混液中，再次搅拌进行灭活24h，得到第三混液；

步骤6、灭活后处理：

再次向第三混液中加入硫代硫酸钠溶液，中和残留的灭活剂；

步骤7、后续检测：

取样检测，按照规程做安全检验和无菌检验。

优选地，所述步骤1中，培养口蹄疫病毒的步骤具体为：

将BHK工作用种细胞逐级放大培养，分别转至2个1000L反应器内，继续采取流加培养基方式，直至罐内细胞密度达到300万个/mL；将反应器温控系统的温度设定值改为4℃，缓慢减少氧气供应，逐步降低搅拌速度；待细胞沉降至罐底时，将罐内的上清液无菌排出；向反应器内加入不含血清的口蹄疫病毒维持液，恢复反应器的氧气供应，恢复搅拌速度；按照0.5％的体积比接入口蹄疫种毒，培养10小时后，每小时取样计数，计算细胞的数量与病变率；待细胞病变率达到90％以上即可。