[发明专利]一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法

权利要求书

1.一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、使用BHK细胞悬浮法培养口蹄疫病毒，得到培养成熟的口蹄疫病毒悬浮培养液；

步骤2、配置口蹄疫病毒灭活剂：

称取氢氧化钠与注射水混合，再依次加入β-萘酚紫溶液和二溴乙胺氢溴酸盐，混合均匀，得到口蹄疫病毒灭活剂；

步骤3、灭活前处理：

向培养成熟的口蹄疫病毒悬浮培养液中，加入三氯甲烷，剧烈搅拌，离心过滤，得到第一混液；

步骤4、首次灭活处理：

将配制好的口蹄疫病毒灭活剂加入至第一混液中，搅拌条件下进行灭活，灭活的前4个小时，每小时取一次样，灭活24h后结束，得到第二混液；

步骤5、再次灭活处理：

再次将配制好的口蹄疫病毒灭活剂加入至第二混液中，再次搅拌进行灭活24h，得到第三混液；

步骤6、灭活后处理：

再次向第三混液中加入硫代硫酸钠溶液，中和残留的灭活剂；

步骤7、后续检测：

取样检测，按照规程做安全检验和无菌检验。

2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤1中，培养口蹄疫病毒的步骤具体为：

将BHK工作用种细胞逐级放大培养，分别转至2个1000L反应器内，继续采取流加培养基方式，直至罐内细胞密度达到300万个/mL；将反应器温控系统的温度设定值改为4℃，缓慢减少氧气供应，逐步降低搅拌速度；待细胞沉降至罐底时，将罐内的上清液无菌排出；向反应器内加入不含血清的口蹄疫病毒维持液，恢复反应器的氧气供应，恢复搅拌速度；按照0.5％的体积比接入口蹄疫种毒，培养10小时后，每小时取样计数，计算细胞的数量与病变率；待细胞病变率达到大于90％即可。

3.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤2中，注射水的温度为35℃，氢氧化钠与注射水混合质量比为0.105:13；β-萘酚紫溶液与注射水的质量比为0.015:13；二溴乙胺氢溴酸盐与注射水的质量比为0.3075:13。

4.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤2中，β-萘酚紫溶液的配置方法为：

称取5gβ-萘酚紫溶解于500ml注射水中，制备成1％的β-萘酚紫溶液。

5.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤3中，三氯甲烷加入的体积为培养成熟的口蹄疫病毒悬浮培养液的0.5％。

6.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤3中，剧烈搅拌的时间为1-2h，离心过滤为先使用阿伐拉珐BTPX710连续流离心机，以1000L/H的速度离心，离心后的毒液经过过滤范围为：0.4-0.8μm的16层深层滤堆。

7.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤4中，口蹄疫病毒灭活剂与第一混液的体积比为15:1000。

8.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤4中，灭活温度设置为30℃，搅拌设置为每50分钟搅拌10分钟，搅拌频率设置为40Hz；灭活的前4个小时，取出的样液中加入硫代硫酸钠溶液进行检测TCID₅₀。

9.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤5中，灭活温度设置为30℃，搅拌设置为50分钟搅拌10分钟，搅拌频率为40Hz；再次加入的灭活剂为第二混液体积的1.5％。

10.根据权利要求1所述的一种悬浮培养口蹄病毒灭活的工艺方法，其特征在于，所述步骤4和所述步骤6中，硫代硫酸钠溶液的质量浓度为50％，加入量为取样体积的2％。