[发明专利]一种体外原核表达肠道沙门氏菌avrA蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种体外原核表达肠道沙门氏菌avrA蛋白的方法。本发明所述的方法包括以下步骤：(S1)设计沙门氏菌的avrA基因的引物，进行avrA基因体外扩增；(S2)重组载体的构建：将扩增后的avrA基因与通过BamH I酶切位点和XhoI酶切位点双酶切后的pGEX‑4T‑1质粒大片段进行重组，得到重组载体pGEX‑4T‑1‑avrA质粒；(S3)重组菌的构建：将步骤(S2)得到的重组载体转化进感受态细胞中；所述的感受态细胞分别为BL21和Rosetta 2表达菌种；(S4)avrA蛋白的诱导表达：将步骤(S3)得到的重组菌在培养基中培养，将适当浓度的IPTG加入培养基中，诱导avrA蛋白表达。本发明实现了avrA蛋白在细菌裂解上清液中表达，使avrA蛋白的活性及功能更接近原始状态。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及一种体外原核表达肠道沙门氏菌avrA蛋白的方法。

背景技术

沙门菌属是肠杆菌科的重要成员之一，包括肠道沙门菌和邦戈尔沙门菌(Salmonella enterica)两个种。其中肠道沙门菌(以前称为猪霍乱沙门菌，)为带鞭毛的革兰阴性杆菌，为兼性厌氧的胞内寄生菌。肠道沙门菌亚种是肠道沙门菌的一个亚种，大部分对人致病的血清型都属于这一亚种。根据鞭毛蛋白和脂多糖的抗原结构差异，沙门菌可分为不同的血清型，现已有2600个以上的血清型被发现，且基本都属于肠道沙门菌，不同血清型感染的宿主谱不同，如某些血清型只感染个别宿主动物，而另外一些血清型为广宿主菌，可感染多种宿主动物，其中肠道亚种主要存在于人类和温血动物中。决定沙门菌宿主范围的可能原因之一为沙门菌通过噬菌体获得了外源的遗传元件而使其具有感染特定宿主的能力。同时窄宿主血清型可能由广宿主菌退化而来，丢失了感染特定宿主的能力，其中也包括沙门菌效应蛋白的获得、丢失及假基因化等影响。猪沙门氏菌病称为猪副伤寒，与猪瘟、猪肺疫、猪丹毒和猪支原体肺炎(猪气喘病)合称为猪的五大传染病。猪因采食污染的饲料或饮水导致发病，临床上分为急性、亚急性和慢性三种类型。常见症状包括发热、败血症、多器官和系统衰竭、腹泻、皮肤上出现出血斑块、角膜炎、弥散性湿疹等症状。

沙门菌致病性相关的毒力因子包括质粒、致病岛、菌毛、Vi抗原和鞭毛等，其中沙门菌致病岛(Salmonella pathogenic Island,SPI)包含大量毒力相关基因，与沙门菌致病性密切相关。SPI是存在于沙门菌染色体及质粒上成簇分布的可编码毒力相关基因的特定区域。大部分SPI都定位于tRNA基因下游，其G+C含量与基因组其他部分不同，使其容易通过水平转移的方式插入到沙门菌基因组中。目前，己知许多病原菌，如大肠埃希氏菌、李氏杆菌、耶尔森菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌、节瘤拟杆菌、金黄色葡萄球菌等都存在毒力岛，而且一种病原细菌往往具有1个或多个毒力岛。沙门菌中至少存在23个毒力岛(SP-1到SP1-23)，SP1的组成与分布在不同血清型中存在很大差异。中其中SP1-1、SP1-2、SP1-3、SP1-4、SP1-5等毒力岛研究得比较清楚。SPI的功能与沙门菌侵袭上皮细胞及在宿主细胞内的定殖与存活密切相关。

通常认为，沙门氏菌的致病力与自身内的毒力岛密切相关，因此毒力岛翻译出的蛋白质对于机体均是有害有毒的。但通过大量文献查阅发现，沙门氏菌对动物来说虽然是一种有害性致病微生物，但它在动物体内表达的某些蛋白质，某种浓度对动物机体却是有保护作用的。

沙门菌毒力岛中表达的蛋白质中有一种蛋白质名为avrA，avrA蛋白能够抑制上皮细胞JNK信号通路，稳定肠上皮细胞紧密连接，阻止细菌的侵袭，降低宿主炎性反应的发生，并抑制感染的宿主细胞凋亡。目前对于avrA效应蛋白功能的研究主要包括鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的，研究的内容主要围绕avrA蛋白的原核表达和克隆方法，仅有蔺志杰等发表在THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY的文章介绍的肠道沙门氏菌avrA蛋白的作用且实验对象是人的肠道细胞，同时该作者通过体外原核表达avrA在包涵体内，蛋白活性及功能较差。