[发明专利]一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用

说明书

本发明属于基因编辑技术在动物免疫学技术领域中的新应用，公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术筛选和鉴定抗血清1型马立克病病毒特异性pp38蛋白单克隆抗体的方法及应用。其中抗MDV‑1特异性pp38蛋白的单克隆抗体31G7由小鼠杂交瘤细胞株pp38‑31G7产生，该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23025，单克隆抗体31G7的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4。该单克隆抗体31G7可以鉴别区分MDV‑2和MDV‑3毒株，适用于临床中疑似病例的MDV不同血清型流行毒株的鉴别诊断。本发明方法大大提高了筛选针对MDV特定病毒蛋白的单克隆抗体的效率和准确性，同时也为其它疱疹病毒蛋白单克隆抗体的研制提供一种全新思路和可靠的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒MDV-1特异性pp38基因编辑缺失毒株，进行MDV-1特异性pp38蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选、鉴定、单克隆抗体制备及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡马立克病(Marek’s disease，MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)早期感染雏鸡引发的一种最重要的免疫抑制病及肿瘤病。主要特征是外周神经、内脏器官(性腺、肝、脾、肺、肾、腺胃、肠道等)、虹膜、肌肉及皮肤内发生淋巴样细胞浸润，并最终发展成为淋巴瘤。MDV可经空气传播，传染能力强，最终会诱发宿主产生内脏肿瘤和大批死亡，对全球养禽业年均导致约10-20亿美元的巨大经济损失，加上MDV感染宿主后产生免疫抑制导致临床疫苗免疫预防效果不佳而产生间接影响，经济损失无法估量。

MDV共有三种不同的血清型：血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和血清3型(MDV-3，即火鸡疱疹病毒HVT)。其中，只有MDV-1毒株具有致病性和致瘤性。根据致病性的不同，MDV-1毒株又可分为温和毒(Mild MDV，mMDV)、强毒(Virulent MDV，vMDV)、超强毒(Veryvirulent MDV，vvMDV)以及特超强毒(Very virulent plus MDV，vv+MDV)。

MDV病毒基因组为线性双股DNA，全长约180kb。主要由一个长独特序列区(Uniquelong，UL)和一个短独特序列区(Unique short，US)构成，在两个独特序列区两侧分别是两个序列完全相同的反转重复序列区：长末端重复序列(Terminal repeat long，TRL)和长内部重复序列(Internal repeat long，IRL)以及短末端重复序列(Terminal repeat short，TRS)和短内部重复序列(Terminal repeat short，IRS)，独特序列区中编码的病毒基因与其它疱疹病毒具有高度保守性，而MDV特异性的病毒基因则主要位于反转重复序列区TR/IR中。三种血清型MDV存在大部分相同的结构基因和功能基因外，致病性的MDV-1还被发现和鉴定编码7个病毒特异性的基因，包括原癌基因meq、pp38基因、病毒端粒酶RNA(vTR)、病毒脂肪酶(vLIP)、病毒相关IL8基因(vIL8)和1.8kb mRNA以及潜伏感染相关转录因子(LATs)。

在MDV-1特异性基因中，38ku磷蛋白pp38是最早被发现的。pp38在MD肿瘤和细胞系中的表达存在差异，且是迄今为止在MDV诱发的肿瘤及非生产性肿瘤细胞系中唯一能检出的MDV-1特异性抗原，参与淋巴瘤细胞MSB-1转化状态的维持。此外，pp38还参与淋巴细胞的早期细胞裂解性感染，对于产生足够量的潜伏感染T细胞以及体内转化状态的维持来说是必需的。

pp38蛋白是MDV-1特有的病毒蛋白，制备识别该病毒蛋白的特异性单克隆抗抗，不仅可用于MDV-1特异性毒株的快速鉴定，还可以为进一步研究揭示pp38蛋白的功能，以及为MDV快速检测诊断试剂的研发提供关键核心试剂。

发明内容