[发明专利]一种猪精液的冷冻保存方法

说明书

本发明涉及一种猪精液的冷冻保存方法，首先制备冷冻稀释Ⅰ液、冷冻稀释Ⅱ液和稀释液BTS，接着对三种溶液进行加氢处理，采精后，将猪精液用加氢处理后的稀释液BTS等温1∶1稀释，然后在17℃下平衡2‑4h，离心去除上清，将精子沉淀用等温的加氢处理后的冷冻稀释Ⅰ液稀释，然后再降温平衡至4℃，最后用等温的加氢处理后的冷冻稀释Ⅱ液1∶1稀释，将稀释后的精液用冷冻细管分装并封口，再置于程序冷冻仪的箱体中进行冷冻，冷冻结束后，将冷冻细管移至液氮中保存。该方法操作简单，可有效提高猪冻精的解冻活力和精子顶体完整率，并能降低精子氧化损伤程度，克服了精子在较长的降温平衡过程中容易遭受氧化损伤的问题。

技术领域

本发明属于家畜繁殖和哺乳动物精液冷冻保存技术领域，涉及一种猪精液的冷冻保存方法。

背景技术

近些年来，猪精液冷冻保存技术得到了长足的发展。猪冷冻精液(简称“猪冻精”)采用深部位输精方法能取得接近常温保存精液的效果，继牛之后也开始步入商业化生产和普及应用的进程。

与其它动物相比，猪精子对低温更为敏感，故其冻精制作需要较长的降温平衡时间。但在较长的降温平衡过程中，精子呼吸代谢会产生大量的活性氧族(ROS)，而ROS导致的氧化损伤是猪冻精品质急剧下降的主要原因。因此，如何抑制精子遭受的氧化损伤问题，是提高猪冻精品质的关键。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种猪精液的冷冻保存方法，该方法可提高猪冻精的解冻活力、精子顶体完整率并降低精子氧化损伤程度。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：

一种猪精液的冷冻保存方法，包括如下步骤：

(1)配制冷冻基础液TCG，往冷冻基础液中加入20～25％的卵黄，搅拌均匀后，得到冷冻稀释Ⅰ液，往冷冻稀释Ⅰ液中加入6％的甘油和0.4～0.6％的OEP(Orvus Es Past)，搅拌均匀后，得到冷冻稀释Ⅱ液；

(2)将稀释液BTS、冷冻稀释Ⅰ液和冷冻稀释Ⅱ液分别置于密闭容器中，通入氢气进行加氢处理，得到加氢处理后的稀释液BTS、冷冻稀释Ⅰ液和冷冻稀释Ⅱ液；

(3)采精，将猪精液用加氢处理后的稀释液BTS等温1∶1稀释，得到预稀释后的精液；

(4)将预稀释后的精液在17℃下平衡2～4h，然后离心，去除上清后，将精子沉淀用等温的、加氢处理后的冷冻稀释Ⅰ液稀释，稀释至精子密度为20×10⁸个/mL，然后降温平衡至4℃，最后用等温的、加氢处理后的冷冻稀释Ⅱ液1∶1稀释，得到稀释后的精液；

(5)将稀释后的精液用冷冻细管分装并封口，然后置于程序冷冻仪的箱体中进行冷冻，冷冻结束后，将冷冻细管移至液氮中保存。

步骤(1)中，所述冷冻基础液TCG的制备方法为：称取葡萄糖1.1g、柠檬酸1.48g、Tris 2.42g、青霉素钠0.06g和硫酸链霉素0.1g，溶于到双蒸水中，搅拌溶解后，定容至100mL。

步骤(2)中，所述稀释液BTS的制备方法为：称取葡萄糖3.7g、二水柠檬酸三钠0.6g、EDTA0.125g、碳酸氢钠0.125g、氯化钾0.075g、青霉素钠0.06g和硫酸链霉素0.1g，溶于双蒸水中，然后定容至100mL，调pH至7.2，渗透压为310mosm/L。

进一步，步骤(2)中，所述加氢处理时，容器内压力为0.6～0.8MPa，处理时间为2～5h。

进一步，步骤(4)中，所述离心条件为：17℃，800～2300g，3～15min。

进一步，步骤(5)中，所述冷冻的程序为：温度从4℃开始，4℃维持30min后以6℃/min的速率降至-5℃，再从-5℃开始以40℃/min的速率降至-80℃，-80℃保持30s后，以60℃/min的速率降至-145℃，完成冷冻。