[发明专利]一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用。本发明尝试在运动发酵单胞菌中构建T7表达系统，用于严谨调控线路的构建，帮助解析有毒基因的功能及实现代谢途径在运动发酵单胞菌中的严谨调控；同时也将构建可以在运动发酵单胞菌与大肠杆菌中使用的穿梭质粒，方便质粒的构建及提高外源基因在运动发酵单胞菌中的表达效率，为后续蛋白的表达与分泌及代谢工程途径优化调控奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用。

背景技术

基因表达调控是生物体内基因表达的控制调节，是一个具有多层次性和复杂性的过程。基因表达调控包括基因水平、转录水平、转录后水平和翻译水平等多个层次的调控，在时间和空间上对细胞中基因的表达起到调节作用。然而，由于基因表达调控过程十分复杂，在基因表达过程中可能对宿主细胞产生毒害或致死作用，制约了基因功能的研究或细胞模型的建立等相关研究。

尽管不同的原核细胞或真核细胞表达调控系统得到了发展，目前的表达调控系统仍存在一定的局限性。例如，对于原核生物而言，其调控表达系统诱导过程缓慢、效率低，缺乏诱导特异性和表达的精确调控等，限制了表达系统的应用。故而期望出现更丰富的基因严谨调控系统，使基因的时空表达受到高效的严谨控制，有效使用细胞的资源。

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，是目前已知唯一通过Entner-Doudoroff(ED)途径进行厌氧发酵的微生物，具有基因组小，乙醇产率高，耐受高糖、高酒精，生长温度(24～45℃)和pH(4.0～8.0)范围广泛等优良特性。由于运动发酵单胞菌的这些特性，使得它在工业化生产酒精等产品具有广阔的应用前景。

近年来也有针对运动发酵单胞菌开展的大量系统与合成生物学、基因工程与代谢工程等方面的研究成果。高通量测序技术的发展使得运动发酵单胞菌多个菌株的基因组序列得到了报道、更新和准确注释，基因组代谢网络建模也为细胞的理性改造和开发提供了指导；内外源CRISPR-Cas基因组编辑体系的开发也提供了新的遗传工具。同时，基于双报告基因的生物元件预测与鉴定系统与组学数据的结合，也成功预测和鉴定了一批包括强、中、弱组成性启动子与乙醇诱导性启动子及不同强度的RBS等生物元件，这些技术和方法的建立均为运动发酵单胞菌的细胞工厂的开发提供了技术支撑。但是，目前针对运动发酵单胞菌基因精准调控系统依然非常缺乏，限制了运动发酵单胞菌在基因功能解析、线路构建、代谢途径时空调控等方面的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：以pZM39(Genbank ID：CP023718)质粒为骨架，利用Gibson组装将T7 RNAP基因、araC基因连接，得到重组质粒；

其中，使用诱导性启动子P_BAD作为基因T7 RNAP的启动子，使用诱导性启动子P_tet作为基因araC的启动子；

步骤2：将步骤1中得到的重组质粒转入运动发酵单胞菌(ZM4)感受态细胞中，获取单菌落，实现T7表达系统在运动发酵单胞菌中的建立。

进一步地，将待表达基因片段转入已建立T7表达系统的运动发酵单胞菌中进行表达。

进一步地，将待表达基因片段转至穿梭质粒中再进行表达；所述穿梭质粒为运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭表达质粒。

进一步地，所述穿梭表达质粒通过将运动发酵单胞菌的复制子替换掉大肠杆菌质粒pET22b或pET28a上的f1 origin获得。