[发明专利]转录调控蛋白突变株及应用

说明书

本发明公开了转录调控蛋白突变株及应用，属于生物技术领域，其技术方案要点是：转录调控蛋白突变株包括C154‑Muts调控蛋白，C154‑Muts调控蛋白不需要阿拉伯糖诱导能够直接启动PBAD启动子下游基因表达；转录调控蛋白突变株还包括AraC‑Muts调控蛋白；步骤S3的筛选体系由1个表达质粒和1个报告质粒组成，表达质粒为pHY‑01质粒，报告质粒为ReporterPlasmid质粒；将转录调控蛋白突变株应用于正反馈基因线路构建。本发明将获得的突变位点引入AraC蛋白后提高了对pBAD下游基因的调控效率，相同的阿拉伯糖诱导剂可以获得更高的表达强度，从而降低了蛋白表达的成本；还利用一系列不同强度的启动子构建了具有不同表达模式的正反馈线路，满足不同的基因表达需求。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及转录调控蛋白突变株及应用。

背景技术

合成生物学是一门新型的交叉学科，以工程化的理念，对生物系统进行重设 计、改造和优化的过程。基因线路的设计和合成是合成生物学非常重要和核心的 一部分内容，在基因线路的设计和合成过程中基因元件就像是每一块积木，选择 不同的基因元件以特定的方式组合，导入活细胞后可以行驶特定的生物功能。因 此，丰富基因元件的组成以及探索每一个元件对基因线路的影响对合成生物学的 发展非常重要。

启动子是基因线路设计中使用到的非常重要的一种基因元件，而转录因子则 像“开关”决定着启动子下游基因的表达。常用的用于原核生物基因表达的启动 子大都是诱导型，例如T7启动子需要IPTG诱导，PBAD启动子需要阿拉伯糖诱 导。诱导型启动子的优点是可以让蛋白更好的在体内表达，但是同时增加了蛋白 表达的成本；并且，目前还具有更多的蛋白表达和基因线路设计的需求亟待满足； 此外，转录调控强度对基因线路表达的影响目前也仍不清楚。

为了解决上述问题，在现有技术的基础上提供了转录调控蛋白突变株及应 用。

发明内容

本发明的目的是提供转录调控蛋白突变株及应用，本发明首先构建了转录调 控蛋白突变株AraC的截短蛋白C154，并证明了C154可以在没有阿拉伯糖诱导 的情况下启动PBAD启动子下游基因的表达，但是调控强度非常弱，不适合用于 基因元件的构建；在C154的基础上，我们通过蛋白质定向演化的手段以及本发 明构建的筛选体系筛选获得了一系列不同调控强度的可以直接启动PBAD下游基 因表达的调控蛋白。

并且，本发明利用这一系列的强度的转录调控蛋白突变株构建正反馈的基因 线路，但是得到的表达模式(双稳态或单稳态)却是不同的，证明了本发明获得 的调控蛋白可以作为基因元件应用于合成生物学中更复杂的基因线路的构建，且 可以用于研究转录调控强度对基因线路表达效果的影响。

此外，本发明进一步将C154-Muts中部分突变位点引入AraC蛋白中获得AraC-Muts，该系列蛋白相比于野生型AraC-Muts具有更高的调控效率，在相同 的阿拉伯糖诱导下可以更强的启动PBAD下游基因的表达，同时在没有阿拉伯糖 诱导下的本底表达水平低，该系列转录因子可以用于更有效的蛋白表达，同时节 约了蛋白表达的成本，证明了本发明具有重要的意义。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

转录调控蛋白突变株，所述转录调控蛋白突变株包括C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋白，所述C154-Muts调控蛋白不需要阿拉伯糖诱导能够直接启 动PBAD启动子下游基因表达；且所述C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋 白的制备方法如下：

S1、以AraC调控蛋白Ⅰ为模板通过分子克隆获得N端153个氨基酸缺失的 片段，并将所述片段进行表达，获得C154蛋白；

S2、验证所述C154蛋白可以在没有阿拉伯糖诱导的情况下启动PBAD启动子 下游基因的表达；