[发明专利]转录调控蛋白突变株及应用

权利要求书

1.转录调控蛋白突变株，其特征是：所述转录调控蛋白突变株包括C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋白，所述C154-Muts调控蛋白不需要阿拉伯糖诱导能够直接启动PBAD启动子下游基因表达；且所述C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋白的制备方法如下：

S1、以AraC调控蛋白Ⅰ为模板通过分子克隆获得N端153个氨基酸缺失的片段，并将所述片段进行表达，获得C154蛋白；

S2、验证所述C154蛋白可以在没有阿拉伯糖诱导的情况下启动PBAD启动子下游基因的表达；

S3、以C154蛋白为起始模板进行蛋白定向演化，通过构建的筛选体系筛选出PBAD启动子的转录调控蛋白突变株，即为C154-Muts调控蛋白；

S4、所述C154-Muts调控蛋白经测序后确定突变位点，通过融合PCR的方法将突变位点引入AraC蛋白Ⅱ中从而获得AraC-Muts调控蛋白。

2.根据权利要求1所述的转录调控蛋白突变株，其特征是：步骤S3所述的筛选体系由1个表达质粒和1个报告质粒组成，所述表达质粒为pHY-01质粒，所述报告质粒为ReporterPlasmid质粒；所述pHY-01质粒和Reporter plasmid质粒的构建方法分别如下：

1)pHY-01质粒的构建：以pBAD-Myc-HisA质粒为模板、以c154-F-NcoI和araC-R-BamHI为引物扩增出C154基因片段利用NcoI和BamHI酶切位点插入到pACYC-duet质粒中，从而得到pHY-01质粒；

2)Reporter plasmid质粒的构建：首先设计引物Pbad-expect araC-F和Pbad-expectaraC-R；通过PCR将所述pBAD-Myc-HisA质粒中的araC基因片段敲除；再通过BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点插入gfpuv片段，即得到Reporter plasmid质粒。

3.根据权利要求2所述的转录调控蛋白突变株的应用，其特征是：将所述转录调控蛋白突变株应用于正反馈基因路线构建，所述正反馈基因线路构建包括PFL质粒和non-PFL质粒的构建；所述PFL质粒和non-PFL质粒的构建方法分别如下：

Ⅰ.PFL质粒的构建：以所述Reporter plasmid为基础，首先在所述Reporter plasmid质粒的gfpuv基因后面插入终止子；然后以所述pHY-01为模板扩增出PBAD-C154/Muts片段，并插入到两个终止子之间；所述PBAD-C154/Muts片段包含PBAD启动子序列和C154序列或PBAD启动子序列和C154-Muts序列；

Ⅱ.non-PFL质粒的构建：以所述Reporter plasmid为基础，首先在所述Reporterplasmid质粒的gfpuv基因后面插入终止子；然后以所述pHY-01为模板扩增出Plac-C154/Muts片段；所述Plac-C154/Muts片段包含PLac启动子序列和C154序列或者PLac启动子序列和C154-Muts序列。