[发明专利]一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器

说明书

本发明属于生物检测技术领域，提供了一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器，包括：核苷酸序列如SEQ NO:1‑7所示的EpCAM‑Apt，P1探针，发卡探针H1、H2、H3、H4，Reporter探针和T7 RNA polymerase，Cas13a/crRNA；所述Reporter探针的5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团。该传感器检测限低，构建方法简单，性能稳定，工艺成本低，适用于产业化生产和检测的要求。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器。

背景技术

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体广泛存在于各种体液中，可携带脂类、蛋白质、信使RNAs、非编码RNAs等多种重要的生物功能分子，能够参与细胞间物质交换和信息交流。

外泌体在医学上具有广阔的应用前景，可以作为外伤或者美容的目的进行应用，其效果依赖于外泌体含量的多少。目前报道的检测外泌体的方法包括质谱和免疫分析，包括western blot和酶联免疫试验（ELISA），但是这些方法需要繁琐的样品前处理，因此限制了它们快速检测外泌体的应用。因此急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对外泌体进行检测。近几年，DNA生物传感检测技术以及Cas系统凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注与应用。其中，荧光发光技术的基础理论研究日益成熟，它在生物学、医学等领域所扮演的角色越来越重要。相对于其他检测手段，荧光技术具有显著的优势，灵敏度高、特异性强、价格低廉。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种检测基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器，检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种基于Cas13a系统的检测外泌体的生物传感器，包括：

核苷酸序列如SEQ NO: 1-7所示的EpCAM-Apt，P1探针，发卡探针H1、H2、H3、H4，Reporter探针和T7 RNA polymerase，Cas13a/crRNA；

所述Reporter探针的5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团；

所述crRNA的核苷酸序列SEQ NO: 8所示。

优选地，所述EpCAM-Apt和P1探针以Apt-P1探针代替，所述Apt-P1探针为EpCAM-Apt和P1探针杂交获得的双链。

一种包含上述生物传感器的检测外泌体的试剂盒。

所述试剂盒还包括外泌体标准品、缓冲溶液。

一种采用上述生物传感器或试剂盒对外泌体进行检测的方法，包括以下步骤：

（1）人工合成EpCAM-Apt，P1探针，发卡探针H1、H2、H3、H4，Reporter探针和crRNA；并获得Apt-P1探针和Cas13a/crRNA；

（2）将待测样品或外泌体标准品与Apt-P1探针在缓冲溶液中混合，反应30 min；然后加入H1、H2、H3、H4反应30-130 min；然后加入T7 RNA polymerase和Cas13a/crRNA于37℃反应30 min；然后加入Reporter探针，反应60min；设置激发波长为485nm，发射波长为520nm，检测荧光信号；

（3）根据外泌体标准品的荧光信号计算待测样品中外泌体含量。

本发明的检测原理如下：

生物传感器用到以下序列：