[发明专利]烯还原酶突变体、工程菌及其制备(2R,5R)-二氢香芹酮的应用

说明书

本发明公开了一种烯还原酶突变体、工程菌及其制备(2R,5R)‑二氢香芹酮的应用，以烯还原酶突变体纯酶为催化剂，以(5R)‑香芹酮为底物，以NAD(P)+为辅因子，以醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶为辅酶，以异丙醇或葡萄糖为辅助底物，以pH 8.0‑10.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30‑40℃，180‑250rpm转速的摇床中反应完全后，反应液分离纯化，获得(2R,5R)‑二氢香芹酮。本发明突变烯还原酶GsOYE‑R13不对称还原(5R)‑香芹酮生产(2R,5R)‑二氢香芹酮的产率提高至99％以上，de_p值提高至99％以上(2R,5R)。

(一)技术领域

本发明涉及一种烯还原酶突变体，具体涉及一种烯还原酶突变体GsOYE-R13及其编码基因，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该烯还原酶突变体GsOYE-R13在催化(5R)-香芹酮制备手性化合物(2R,5R)-二氢香芹酮中的应用。

(二)背景技术

烯还原酶(EC1.6.99.1)属于氧化还原酶，能催化活化烯烃的不对称还原，其在加氢的同时可以引进一个或两个手性中心，对α,β不饱和酮、醛、硝基烯烃和羧酸的催化还原有立体选择性和对映选择性。烯还原酶的基本结构单位是由TIM桶中间含有FMN，是NAD(P)H依赖性氧化还原酶。烯还原酶活性中心区域的组氨酸和天冬酰胺残基在底物不对称还原中起着重要作用。

与化学水解法相比生物转化法具有效率高、条件温和、环境污染小、并能在无额外引入保护/修饰基团的情况下实现化学、区域和对映体选择性等优点。为了在工业上利用烯还原酶催化生产α、β不饱和酮、醛类化合物，降低该酶的制造成本尤为重要。具体而言，必须提高单位重量酶制备物中烯还原酶的含量。随着生物技术的迅速发展，用基因工程技术手段来构建具有烯还原酶活性的基因重组菌株可以用来克服上述的缺点。此外，利用基因重组菌来表达烯还原酶可以定向改造烯还原酶，以避免催化反应过程中副反应的发生，并提高产物产量。相比于化学合成法使用高温及价格较为昂贵的金属催化剂等，生物酶催化操作简单，对映体选择性高，收率高，成本低，安全环保，解决化学法能耗高、污染大、操作繁琐等问题。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种烯还原酶突变体GsOYE-R13，含有该突变体编码基因的质粒及重组基因工程菌，以及该烯还原酶突变体GsOYE-R13在催化(5R)-香芹酮制备手性化合物(2R,5R)-二氢香芹酮中的应用，有效提高了产物对映体选择性和产率。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种烯还原酶突变体(GsOYE)，所述烯还原酶突变体是将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第270位进行定点突变获得的，优选所述烯还原酶突变体是将SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第270位天冬酰胺突变为丙氨酸，记为GsOYE-R13，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MLKLLEPFDLNGLELANRMVMAPLTRNRAGPRFVPTKMNALYYAQRSGLGLIITEATQISQQGMGYPDTPGIYTDEQVDGWRMVTEAVHRREGCIFLQLWHVGRVSHSSFQPNGQLPVAPSAIAPEGEVMTYDGIKPFETPRALETEEVAHIVEDYRKAAINAKRAGFDGIEIHSANGYLLHEFLEDGTNKRTDRYGGSIENRTRIVFEVLDAVCKVYPSRRVGIRLSPDTEFMSMSDSDRPALYSYLVQELSRRELAYLHLIEPRIKGAVDVEKESSLNVEFFRPLYKGVLITAGGYQKETGEERLQKQHADLVAYGRWVIANPDLPSRFEQNAPLNPYDRATFYGGNEKGYTDYPFLDPRDSQEALKEAEAAERKWRRL。

本发明还提供一种所述烯还原酶突变体编码基因，记为Gasu-R13，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：