[发明专利]一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法

说明书

本发明公开一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，包括以下步骤：（1）对分离的中华乌塘鳢精巢进行消毒、清洗、剪碎，加入精巢消化液进行消化，然后经过滤网过滤去除未消化的细胞碎片或者细胞团，制得精巢单细胞悬液；精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液中进行离心，分离得到精原细胞；percoll梯度溶液由22~30%和35~45%两种浓度组成percoll溶液；（2）精原细胞转移到3D培养皿中，用精子诱导培养基进行培养；精子诱导培养基包括基础精子培养基和性激素，进一步还包括褪黑素。该方法从精原细胞的分离、培养和诱导条件进行了优化和改良，提高体外培养精原细胞产生具有功能的精子的效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法。

背景技术

鱼类养殖对世界食品特别是动物蛋白的持续供给做出了至关重要的贡献。近十年来，生物技术的创新在鱼类一些重要经济性状的解析和遗传改良取得了重要进展。鱼类遗传育种已从传统选择育种和杂交育种，发展至细胞工程育种、性别控制育种、分子标记辅助选择育种和全基因组选择育种等精准设计育种。鱼类遗传育种基础研究和技术的进步推动中国鱼类种业的形成和蓬勃发展。随着养殖规模的扩大，鱼类养殖面临优良种质资源和苗种短缺等问题，创制养殖鱼类优良种质是水产养殖行业健康持续发展亟待解决的问题。

目前，生殖细胞操作技术，例如生殖干细胞移植和生殖干细胞诱导，是快速获得优良种质的潜在途径，对于缩短鲟、鲑、鳟、草鱼和石斑鱼等繁殖长的鱼类的育种周期具有重要意义。生殖干细胞移植，俗称“借腹怀胎”技术，将供体生殖干细胞移植到不育的受体中，受体成熟后产生供体的配子（即精子或者卵子）。借腹怀胎技术已被成功应用于鲑鱼、虹鳟、牙鲆和大菱鲆等养殖鱼类中，产生具有功能的配子。然而，生殖干细胞培养和体外产生功能的配子尚未在养殖鱼类中报道，其仍然是一个技术领域中的难题。

精子发生（spermatogenesis）是一个复杂而有序的生物学过程。依据精原干细胞（spermatogonia stem cell，SSC）的行为，精子发生划分为三个重要事件：SSC自我更新、SSC转换为分化的精原细胞以及减数分裂产生单倍体精子。精子发生受SSC微环境的精准调控，包括SSC和体细胞的相互作用、内分泌因子以及细胞外基质的黏附等。

在日本青鳉中，洪云汉等建立首个鱼类SSC细胞系—SG3，长期培养SG3可产生游动的精子。然而，现有的细胞培养体系难以在体外长期维持鱼类SSC的增殖能力和生殖干性，因此还没有在其他鱼类中建立SSC细胞系的报道。现有技术中，研究人员主要将含有SSC的精巢消化成单细胞悬液，在不同的体系进行培养和诱导分化；但是发现SSC难以直接黏附在明胶、蛋白等基质包被的培养皿上。因此SSC通常与性腺体细胞共培养，SSC黏附在贴壁的性腺体细胞饲养层上，进而增殖和分化。然而，大多数鱼类性腺体细胞也存在多次传代之后难以继续增殖的瓶颈。目前，仅在斑马鱼和虹鳟中成功建立稳定的性腺体细胞系ZtA6和RTG-2。由于饲养层细胞（性腺体细胞）对精原细胞发育的影响因物种而异，共培养系统也仅推广于斑马鱼、日本青鳉（利用RTG-2）和虹鳟。因此，鱼类生殖细胞培养和诱导系统仍然匮乏，尤其在养殖鱼类的群体中。

此外，虽然2D培养SSC取得了一定进展，但因其缺乏相对立体的空间结构，不能有效地模拟体内SSC微环境（niche）而导致诱导产生精子的效率较低。精巢被认为是一种特殊的3D结构，因而开发3D培养系统模拟SSC的微环境（niche），加深生殖细胞与体细胞和微环境的相互作用，可以促进SSC体外产生精子。近年来，利用人工材料（软琼脂、甲基纤维素、纳米纤维）或者脱细胞生物支架模拟体内SSC微环境的3D培养法，研究人员成功将小鼠SSC、大鼠SSC和无精人类患者的SSC诱导产生精子。然而，至今尚未建立鱼类生殖细胞的3D培养系统。