[发明专利]一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法

权利要求书

1.一种3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）对分离的中华乌塘鳢精巢进行消毒、清洗、剪碎，然后加入精巢消化液进行消化，消化后的细胞经过滤网过滤去除未消化的细胞团，制得精巢单细胞悬液；然后精巢单细胞悬液加入percoll梯度溶液中，进行离心，分离得到精原细胞；所述percoll梯度溶液为由22~30%和35~45%两种浓度组成 percoll溶液；

（2）将精原细胞转移到3D培养皿中，用精子诱导培养基进行培养；所述精子诱导培养基包括基础精子培养基和性激素；所述性激素包括人绒毛膜促性腺激素、妊娠母马血清促性腺激素、11-酮睾酮、睾酮、17β-雌二醇和17α，20β-二羟基-4-孕3-酮。

2.根据权利要求1所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，在基础培养基中添加的性激素，包括：5~20 U/ml人绒毛膜促性腺激素、5~20 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素、50~200 ng/ml 11-酮睾酮、50~200 ng/ml睾酮、50~200 ng/ml 17β-雌二醇和20~70 ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮。

3.根据权利要求2所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，在基础培养基中添加的性激素，包括：10 U/ml人绒毛膜促性腺激素、10 IU/ml妊娠母马血清促性腺激素、100 ng/ml 11-酮睾酮、100 ng/ml睾酮、100 ng/ml 17β-雌二醇和50ng/ml 17α，20β-二羟基-4-孕3-酮。

4.根据权利要求1-3任一项所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述精子诱导培养基还包括褪黑素。

5.根据权利要求4所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述褪黑素的添加量为0.1~10 μM。

6.根据权利要求5所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述褪黑素的添加量为1μM。

7.根据权利要求6所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述percoll梯度溶液的成分为25%和40% percoll溶液。

8.根据权利要求7所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述步骤（2）进行精原细胞培养过程中，每隔3天更换一半新鲜的精子诱导培养基。

9.根据权利要求8所述的3D体外培养中华乌塘鳢精原细胞产生功能精子的方法，其特征是，所述精巢消化液由以下成分组成：L-15培养基、青霉素、链霉素、IV型胶原酶、胎牛血清、胰酶和DNA酶；所述基础精子培养基为在DMEM培养基中添加10%胎牛血清，2%鲈鱼血清，100 ng/ml 表皮生长因子，10 ng/ml 成纤维生长因子，100 ng/ml类胰岛素生长因子1和0.1 mM β-巯基乙醇。