[发明专利]用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方法和应用。该纳米试剂由透明质酸、第四代聚酰胺‑胺树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂组成。该纳米试剂可实现高效的细胞核药物递送、诱导细胞凋亡并使各类细胞转化为微米级的囊泡，转化率达100％，重点实现了无需外场刺激即可高效诱导细胞产生均一且稳定的微米囊泡，经小鼠体内静脉注射后，该试剂可实现高效的肿瘤富集。另外，本发明还证明了该试剂诱导肿瘤细胞形成的细胞微米囊泡具有良好的免疫刺激效果，可以激活免疫系统进行肿瘤杀伤。由于该试剂具有良好的安全性，并能普适性地诱导各类细胞形成微米囊泡，有望成为一种新型的免疫刺激材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂、细胞微米囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

如今，癌症仍然是对人类生命的致命威胁，而传统的癌症治疗方法包括手术、化疗和放疗的治愈率有限，副作用严重。近年来，癌症免疫治疗在癌症治疗中显示出巨大的前景。各种癌症免疫治疗方法，如免疫检查点阻断疗法、肿瘤疫苗和嵌合抗原受体T细胞疗法，已被广泛研究并取得了理想的效果。其中，肿瘤疫苗能引起肿瘤特异性免疫刺激，是最重要的免疫治疗策略之一，在癌症治疗方面有着巨大的潜力。但是，截止目前，肿瘤疫苗的应用仍局限于癌症预防阶段，而在癌症患者中引发实质性的免疫反应仍然是一个巨大的挑战，主要是由于这些疫苗的免疫原性不足、免疫抑制肿瘤微环境和这些疫苗所含抗原与特定患者肿瘤的相关性较低等原因造成的。因此，如何开发出一种既可以有效刺激患者机体免疫反应，又能保证安全性的肿瘤疫苗是一个亟待解决的问题。另外，肿瘤细胞来源的囊泡结构具有良好的生物相容性和肿瘤靶向性，并包含了所有的肿瘤危险刺激因子。近年来，肿瘤细胞来源的囊泡被广泛研究并应用于纳米药物的包裹、小分子药物的递送和肿瘤疫苗等领域并取得了不错的进展。然而，尽管目前已经报道了几种产生细胞源性囊泡的策略，但其中大多数都需要复杂和严格的物理刺激条件(如光照)，因此不适合用于原位产生癌细胞来源的囊泡。此外，这些方法的囊泡生成率较低，囊泡的大小和形状不均匀，严重阻碍了癌细胞衍生囊泡的临床应用。因此，发展能简便且高效地制备细胞来源囊泡的方法是一个重要的研究方向。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于细胞杀伤和诱导细胞出泡的纳米试剂，实现了无需外场刺激即可高效诱导细胞产生均一且稳定的微米囊泡，同时本发明所述的纳米试剂可以实现高效的细胞核药物递送、诱导细胞凋亡并使细胞转化为微米级的囊泡。

本发明还提供所述的纳米试剂的制备方法和应用。

本发明的第三个目的提供所述纳米试剂制备的细胞微米囊泡及其制备方法和应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述的一种用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂，所述试剂为主要由透明质酸、第四代聚酰胺-胺(PAMAM G4)树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂(如阿帕替尼、拉帕替尼、索拉非尼或达沙替尼)四种成分构成。

其中，所述透明质酸、树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂的质量比为5-20：10-30：2：1。

作为优选，透明质酸、树枝状高分子、阿霉素和酪氨酸激酶抑制剂的质量比为6.9：14.7：2：1。

本发明所述用于诱导细胞出泡的试剂的制备方法，包括以下步骤：

本发明所述的用于细胞杀伤及出泡的纳米试剂(其中的酪氨酸激酶抑制剂为阿帕替尼)的制备方法，包括以下步骤：

(1)向盐酸阿霉素的甲醇溶液中加入三乙胺，得到阿霉素的甲醇溶液；

(2)将树枝状高分子、阿霉素和阿帕替尼三种组分共溶于甲醇，并混合均匀；

(3)将混合溶液用氮气吹干；

(4)向以上干燥过的混合物中加入去离子水进行水化，涡旋形成纳米颗粒；