[发明专利]一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法

说明书

本发明一种产顺‑11‑十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，具体步骤如下：(1)制备菌悬液；(2)在无菌条件下，取菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，进行氮离子注入诱变；(3)将经过氮离子注入诱变的菌液进行稀释，均匀涂布在M4培养基上，恒温培养；(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；(5)经过发酵培养，得出能够稳定产顺‑11‑十六碳烯醛的破囊壶菌菌株。本发明方法操作简单、效率高、成本低，易于推广。经本发明方法获得的菌株，较野生型破囊壶菌顺‑11‑十六碳烯醛产量提高最多可达65.18％，远超同类方法，能够产生巨大的经济效益。

技术领域

本发明涉及一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，特别涉及一种破囊壶菌进行氮离子诱变进行选育，从而获得高产菌株的方法。

技术背景

小菜蛾作为农业生产中最为常见的害虫之一，广泛分布在中国多个粮食产区。近年来，有许多学者鉴定出顺-11-十六碳烯醛是小菜蛾信息素的主要有效成分，利用小菜蛾信息素可以高效、精准的诱捕并杀死害虫，达到绿色防治的目的。然而，目前市场上多数使用化学合成法生产顺-11-十六碳烯醛，造成了不必要的环境污染和资源浪费。因此，筛选并培育高产顺-11-十六碳烯醛的破囊壶菌迫在眉睫。

在微生物菌种选育过程中，氮离子诱变是主要方法之一。利用简单高效的氮离子诱变技术，可以使菌株在非自然条件下大幅提高突变效率，进而挑选出所需的高产菌。提高破囊壶菌的顺-11-十六碳烯醛产量可以大幅提高发酵效率，带来巨大的经济效益。

关于培育破囊壶菌产脂肪酸的方法有很多，如专利(CN201811209492.X)采用紫外光诱变破囊壶菌使其高产二十二碳六烯酸，虽然操作简单、成本低，但是有利变异少，诱变的方向和性质不能控制；或如专利(CN201911192842.0)通过改良破囊壶菌液体MP培养基及破囊壶菌发酵培养基来达到高产脂肪酸的目的，虽然培养基配方简单，能源利用高，利于工业化生产，但是所产总脂肪酸含量不高，且棕榈酸和DHA的含量均低于0.6g/L；或如专利(201911104758.9)中采用化学合成法合成顺-11-十六碳烯醛，虽然操作简单，反应条件温和，但是所产生的副产物会造成污染，不如生物制备法绿色安全。

发明内容

本发明的目的是提供一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，突破微生物法产顺-11-十六碳烯的产量瓶颈。

本发明的技术方案概述如下：一种产顺-11-十六碳烯醛破囊壶菌菌株的培育方法，其具体步骤如下：

(1)取破囊壶菌于活化培养基中得活化菌液，将活化后的菌液离心，去除上清液，用无菌生理盐水将菌体悬浮，获得细胞浓度在10⁷～10⁹CFU/mL的菌悬液；

(2)在无菌条件下，取步骤(1)获得的菌悬液均匀平铺在固体培养皿中，平铺量为1.5～2mL/cm²，进行氮离子注入诱变，注入能量为20～40keV，氮离子注入量为5～50×10¹⁴ions/cm²；

(3)将步骤(2)中经过氮离子注入诱变的菌液用无菌生理盐水稀释体积50～150倍，取稀释后的菌液均匀涂布在M4固体平板培养基上，涂布的量为50～100μL/cm²，放入培养箱中培养；

(4)于M4平板上挑选出单菌落作为初筛菌；

(5)将步骤(4)中获得的初筛菌进行发酵培养，得到能稳定产顺-11-十六碳烯醛的破囊壶菌菌株。

优选步骤(1)中所述的活化培养基的成分为：葡萄糖50～55g/L、无水乙醇5～8g/L，酵母提取物2～3g/L、K₂HPO₄ 0.2～0.3g/L，人工海盐13～14g/L、蛋白胨0.1～0.2g/L。