[发明专利]一种防治核桃黑斑病的复合菌剂和制备方法及其应用

权利要求书

1.本发明的解淀粉芽孢杆菌和绿针假单胞菌其特征在于：

所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB191于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20525；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20524。

2.本发明所述复合生防菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤(1)活化菌株：将保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上的解淀粉芽孢杆菌AB191划线于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，绿针假单胞菌PCK02划线于KMB培养基上，28℃倒置培养1-2d；

(2)制备种子液：挑取步骤(1)培养基平板上的单菌落分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基和KMB液体培养基中，28℃摇床振荡24h得到种子液；

(3)发酵培养：将液体发酵培养基A灭菌，步骤(2)所得解淀粉芽孢杆菌AB191的种子液按5％-8％体积比接入发酵培养基A，发酵罐设置恒温30±1℃，搅拌速度180-220rpm，发酵48-72h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到2.0×10¹¹个/mL以上时终止发酵；

将液体发酵培养基B灭菌，步骤(2)所得绿针假单胞菌PCK02的种子液按8％-10％体积比接入发酵培养基B，发酵罐设置恒温32±1℃，搅拌速度220-250rpm，发酵48-60h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到1.0×10¹¹个/mL以上时终止发酵；

(4)菌剂制备：将步骤(3)发酵所得两种菌液按质量比例1:1混合得到混合菌液，按照混合菌液的质量比例0.1-0.8％加入羧甲基壳聚糖，之后再分别与硅藻土、高岭土以1:(4.0-4.5):(5.5-6.0)的质量比混合均匀，形成复合菌体-硅藻土-高岭土混合物；再将按质量比例(％)0.01-0.05％的比例加入(NH₄)₂HPO₄，质量比例(％)0.005％-0.01％的比例加入十二烷基磺酸钠，混合搅拌均匀，即为防治核桃黑斑病复合菌剂(菌数1.0×10¹⁰个/g)。

3.根据权利要求2所述的复合生防菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵培养基A配方为(g/L)：葡萄糖10-15，柠檬酸钠5-10，Na₂HPO₄ 1.5-2.0，(NH4)₂SO₄ 3.5-4.0，MgSO₄ 0.3-0.5，酵母浸粉0.05-0.1，CaCl₂·2H₂O 0.05-0.1，橙皮精油0.5-1.0，调节pH7.0-7.2。

4.根据权利要求3所述的复合生防菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中发酵培养基B配方为(g/L)：甘油15-20，胰蛋白胨2.8-3.0，水解酪素1.5-2.0，K₂HPO₄·3H₂O 1.8-2.2，(NH₄)₂SO₄ 1.0-1.6，FeSO₄·7H₂O 0.05-0.10，ZnCl₂ 0.02-0.05，L-天冬氨酸0.01-0.02，调节pH 7.2-7.4。

5.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB191和绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02菌株或权利要求2所述的复合生防菌剂在防治病原菌野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris和成团泛菌Pantoeaagglomerans)引起的中核桃黑斑病的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在使用前，将制得的生防菌剂用水稀释至1-9×10⁸个/g，在核桃作物叶片喷施处理，防治作物病害的发生发展。