[发明专利]一种抗性HPPD基因的克隆表达的方法在审
| 申请号： | 202210218773.1 | 申请日： | 2022-03-04 |
| 公开（公告）号： | CN114350689A | 公开（公告）日： | 2022-04-15 |
| 发明（设计）人： | 张磊;周立邦;牛冬冬;杨猷建;李林 | 申请（专利权）人： | 南京厚土生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/31 | 分类号： | C12N15/31;C12N15/70 |
| 代理公司： | 江苏德耀知识产权代理有限公司 32583 | 代理人： | 崔娟 |
| 地址： | 211100 江苏省南京市江宁开发区*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 抗性 hppd 基因 克隆 表达 方法 | ||
1.抗性HPPD基因的克隆表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：在土壤中进行采样，采样后进行破碎制样，并称取2.0g样品；
步骤二：配置培养基，培养基包括在50mL MSM溶液中加入2000μmol/L硝磺草酮；
步骤三：将2.0g样品加入在配置完成的培养基中，并放置在30℃的环境下，180r/m富集培养5d，得到培养物；
步骤四：采用SDS-高盐法提取抗性菌株基因组DNA，根据16S rRNA基因通用引物27F/1492R中进行序列比对；
步骤五：检索并下载同源性高的模式菌株的16S rRNA基因序列，在MEGA6.0软件中，利用邻接法构建进化树；
步骤六：根据同属的Stenotrophomonas indicatrix WS40T的hppd基因序列，设计引物对Sthppd-F/Sthppd-R，以菌株MST-5基因组DNA为模板，PCR扩增Sthppd基因，并克隆到pMD18-T载体上，然后转化至E.coli DH5a中，提取阳性克隆子的质粒并对Sthppd基因进行测序，通过NCBI数据库中BLASTN和BLASTP对获得的Sthppd基因序列进行核酸和蛋白序列的比对分析；
步骤七：进行克隆表达处理。
2.根据权利要求1所述的抗性HPPD基因的克隆表达的方法，其特征在于，所述根据16SrRNA基因通用引物27F/1492R的具体操作为：PCR扩增抗性菌株的16S rRNA基因序列，PCR产物TA克隆至pMD18-T载体，转化至Escherichia coli DH5a，提取阳性克隆子质粒并进行测序，得到的抗性菌株的16S rRNA基因序列提交至在线网站。
3.根据权利要求1所述的抗性HPPD基因的克隆表达的方法，其特征在于，所述抗性菌株克隆表达的具体步骤为：在氨基酸序列文库中，通过同源序列比对找到其HPPD以及对应的hppd基因，并以此设计引物对Sthppd-F和Sthppd-R，以菌株MST-5基因组DNA为模板，利用PCR成功扩增出了hppd基因，命名为Sthppd，经测序，Sthppd长为1071bp，GC含量为62％，编码356个氨基酸。
4.根据权利要求3所述的抗性HPPD基因的克隆表达的方法，其特征在于，所述的氨基酸序列文库为Stenotrophomonas indicatrix WS40T氨基酸序列文库。
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