[发明专利]一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种C5‑酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用。所述C5‑酮基米尔贝霉素生产菌株是以含有milF基因的米尔贝霉素A3/A4产生菌株为出发菌株，然后向出发菌株中插入crRNA干扰milF基因表达所得。所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，所述milF基因的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了C5‑酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法与应用。本发明提供的C5‑酮基米尔贝霉素生产菌株构建方法简单，不需要利用同源重组进行基因敲除的单交换筛选、双交换筛选等复杂流程，仅仅通过对携带所述crRNA的pRimilF接合转移就可以实现milF基因沉默，缩短了C5‑酮基米尔贝霉素的生产工艺周期，减少了昂贵试剂的使用，大幅降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

米尔贝霉素在国际上又被称为弥拜霉素，于1975年日本三共株式会社公司在筛选微生物发酵液时发现的物质，具有广谱防治活性，活性高，用量小，对人畜安全，不污染环境，对天敌无害，不易产抗性。米尔贝霉素主要成分为米尔贝霉素A3和A4，属16元大环内酯类抗生素，其结构与阿维菌素相类似，是一种微生物源杀虫杀螨剂，作用机理新颖，通过害螨或害虫的谷氨酸门控的Cl^-通道的开放，从而使Cl^-内流增加，带负电荷的Cl^-引起神经元休止电位超级化，使正常的动作电位不能释放，导致昆虫麻痹死亡。而其衍生物米尔贝肟主要通过增强虫体的抑制性神经递质GABA的释放使虫体麻痹死亡。米尔贝霉素对各种螨虫、农业害虫以及园艺害虫也有很好的防治效果，由于米尔贝霉素的渗透传导作用，喷洒在植物叶片上表面的药剂可渗透到叶片下表面，杀死靶标螨虫并对其形成长效的防治，另外，米尔贝霉素的杀螨活性也不易受温度的影响且作用机理不同于传统杀螨剂，对一些已生产抗性的害螨仍有很高的防效，因此被认为是当今世界上最优良的杀螨剂。

目前，米尔贝霉素现已在美国、日本等43个国家和地区进行了登记，但我国目前仍未进行米尔贝霉素及其衍生物的农药登记，其肟化物在我国已商品化用于兽药，可有效预防犬心丝虫症及驱除肠道内的寄生虫，如蛔虫、钩虫等。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和A4的肟衍生物，对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。米尔贝肟较为普遍的是通过半合成的方法生产。首先由米尔贝霉素A3/A4产生菌株发酵得到米尔贝霉素A3/A4，然后将其C5-羟基氧化成酮。这种C5-酮米尔贝霉素与盐酸羟胺在二噁烷-甲醇-水中发生反应，得到米尔贝肟。显然，如果能获得直接产C5-酮米尔贝霉素的菌株，将缩短米尔贝肟的生产工艺，大幅降低生产成本。

根据已阐明的米尔贝霉素生物合成途径可知，米尔贝霉素A3/A4的生物合成首先形成C5-酮米尔贝霉素，再在milF基因编码的C5-酮还原酶作用下将C5位还原成羟基，得到米尔贝霉素A3/A4。2015年黄隽等人(黄隽、林甲檀、周敏、白骅，吸水链霉菌HS023 milF基因敲除构建5-酮米尔贝霉素基因工程菌，微生物学报，2015，55(1):107-113)利用同源重组的方法进行了milF基因敲除，获得了一株C5-酮米尔贝霉素基因工程菌。然而利用同源重组进行基因敲除操作复杂且耗时较长，需要进一步研究生产C5-酮基米尔贝霉素的工程菌的构建方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用。

本发明的技术方案如下：

一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株，所述C5-酮基米尔贝霉素生产菌株是以含有milF基因的米尔贝霉素A3/A4产生菌株为出发菌株，然后向出发菌株中转化携带crRNA的CRISPRi质粒，从而干扰milF基因表达所得。

根据本发明优选的，所述出发菌株为吸水链霉菌或冰城链霉菌。

根据本发明优选的，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。