[发明专利]一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法及应用

权利要求书

1.一种C5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述C5-酮基米尔贝霉素生产菌株是以含有milF基因的米尔贝霉素A3/A4产生菌株为出发菌株，然后向出发菌株中转化携带crRNA的CRISPRi质粒，从而干扰milF基因表达所得。

2.如权利要求1所述的C5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述出发菌株为吸水链霉菌或冰城链霉菌。

3.如权利要求1所述的C5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的C5-酮基米尔贝霉素生产菌株，其特征在于，所述milF基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述的C5-酮基米尔贝霉素生产菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)以milF基因作为靶基因，在开放阅读框内搜索ddCpf1酶原间隔序列临近基序识别靶基因序列的TTTV，选取原间隔序列临近基序之后的24个核苷酸为原间隔序列，即得到干扰milF基因表达的crRNA，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；然后将crRNA插入至质粒载体pSET-ddCpf1的4656位点处，得到重组质粒pRimilF；

(2)将重组质粒pRimilF转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选后得到转化子；然后将转化子接种于LB液体培养基中，过夜培养，再转接于LB液体培养基中，培养至OD600值为0.4～0.6，离心后去除上清液，用LB液体培养基悬浮沉淀，得到转化子悬浮液；

(3)收集出发菌株的孢子至无菌TES溶液中，得到浓度为1×10⁸～1.5×10⁸个/mL的孢子悬浮液；将转化子悬浮液和孢子悬浮液混合后离心，去除75～85％上清液，通过剩余上清液重悬孢子并涂布于MS固体培养基上，在28～30℃下倒置培养16～19h后，在MS固体培养基上涂布含有萘啶酮酸和阿泊拉霉素的水溶液，继续置于28～30℃倒置培养6～8d，得到接合子单菌落；

(4)挑取接合子单菌落接种于MS固体培养基上，在28～30℃下培养6～8d，挑选阳性重组菌，再转接于斜面固体培养基上，在28～30℃下继续培养6～8d，得到C5-酮基米尔贝霉素生产菌株。

6.如权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述质粒载体pSET-ddCpf1为含有ddCpf1酶编码基因的质粒载体pSET152。

7.如权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述斜面固体培养基组分如下：蔗糖5.0g/L，脱脂奶粉1.0g/L，K₂PO₄ 0.5g/L，麦芽提取物4.0g/L，pH 7.3。

8.权利要求1所述C5-酮基米尔贝霉素生产菌株在制备C5-酮基米尔贝霉素中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括步骤如下：

将C5-酮基米尔贝霉素生产菌株接种于的种子培养基中，在28～30℃，200～230rpm条件下培养36h，收集菌丝，然后将种子液按照6～10％的体积比接种至发酵培养基中，28～30℃，200～230rpm条件下培养8～10天，得发酵液，从发酵液中分离得到C5酮基米尔贝霉素。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述种子培养基组分如下：蔗糖8.0g/L，酵母提取物5.0g/L，蛋白胨3.5g/L，脱脂奶粉2.0g/L，K₂PO₄ 0.5g/L，pH7.3；所述发酵培养基组分如下：蔗糖90.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，脱脂奶粉8.0g/L，棉籽蛋白粉5.0g/L，CaCO₃3.0g/L，K₂PO₄ 0.5g/L，FeSO₄ 0.5g/L，pH7.5。