[发明专利]一种碱性成纤维细胞生长因子制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种碱性成纤维细胞生长因子制备方法，包括以下步骤：融合质粒构建；工程菌构建；将上述工程菌培养于培养基，当大肠杆菌的OD值达到2值，温度调为32℃诱导16小时，收集菌体，破碎，离心取上清；将上清37℃下水浴加热，37℃离心，取沉淀部分；向沉淀部分加入预冷的PBS后负40度冷冻2小时，超声溶解，低温离心取溶解部分；溶解部分加入带自备的His‑Tag的EK酶，冰水中酶切12小时；酶切完成后，蛋白质溶液过Ni‑NTA层析柱，ELP‑IDP标签以及带His‑Tag的EK酶将结合至层析柱上，收集流穿部分。bFGF在促进细胞生长增殖方面应用。本发明所制备bFGF的可溶性得到显著提升；同时大幅度简化纯化步骤，具有良好的经济价值。

技术领域

本发明属于蛋白质技术领域，具体涉及一种碱性成纤维细胞生长因子制备方法及其应用。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子（Basic fbroblast growth factor，bFGF，或者FGF-2）是FGF家族的重要成员。作为单链蛋白，bFGF具有146个氨基酸和pI为9.6。研究报道显示bFGF在不同的细胞和器官系统中具有多效性。bFGF可以刺激平滑肌细胞生长，伤口愈合，以及损伤组织修复。此外，bFGF对肺，生殖系统，神经系统，皮肤，眼睛，造血系统，肌肉，骨骼和消化系统的分化起重要作用。相关研究表明bFGF可以预防大鼠脑缺血再灌注损伤。

基于bFGF重要作用，医药工业上对特别是在无血清细胞培养基添加剂对bFGF有巨量需求。从动物器官和组织（包括腺瘤，脑，下丘脑，胸腺和肾）提取的bFGF，由于bFGF在组织中的含量非常低，因此几乎不可能从动物组织中大量获取bFGF。1986年研究者克隆bFGF的人类基因并进行外源表达，在随后的几十年中，bFGF在各类表达系统进行重组表达。常规的表达系统如大肠杆菌表达的bFGF，基本以包涵体的形式存在，包涵体难以复性成有生物活性的bFGF，研究显示，bFGF在各类菌株中的直接表达，每升培养基只能产生约1-10mg可溶性蛋白质。为了克服这一缺陷，有研究报道采用融合表达方式进行重组表达可提高可溶性，如maltose，binding protein (MBP)、谷胱甘肽S-转移酶（GST）以及硫氧还蛋白（Trx）。这些融合表达纯化方法只能部分解决可溶性表达问题，未见有大幅度提高bFGF可溶性表达研究报道。加之采用常规的色谱纯化程序较为复杂，bFGF的产率严重偏低，难以产生经济效益。

之前有研究者与我们课题组将目的蛋白与弹性蛋白（elastin-likepolypeptides，ELP）融合后，可提高目的蛋白可溶性；但采用使用可逆相变循环方式进行纯化时，目的蛋白损失量较大，会导致相应制备工艺所产生的经济效益欠佳。

据此，有效提升bFGF可溶性表达，快速且简易纯化bFGF蛋白，并提高bFGF蛋白纯化得率，是本发明要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种碱性成纤维细胞生长因子制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种碱性成纤维细胞生长因子制备方法，包括以下步骤：

S1：ELP-IDP-bFGF质粒的构建：其中ELP-IDP-bFGF质粒的基因序列如SEQ ID NO1所示；

S2：大肠杆菌工程菌构建：将上述带有ELP-IDP-bFGF质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌中，得到工程菌；

S3：将上述工程菌培养于LB培养基，当大肠杆菌的OD值达到2值，温度调为32℃诱导16小时，收集菌体，破碎，4℃离心取上清；

S4：将上述步骤得到的上清37℃下水浴加热，37℃离心，取沉淀部分；

S5：向沉淀部分加入预冷的PBS后负40度冷冻2小时，超声溶解，低温离心取溶解部分；

S6：溶解部分加入带自备的His-Tag的EK酶，冰水中酶切12小时；