[发明专利]一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法

权利要求书

1.一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、牛跟腱预处理：将“Y”字型牛跟腱于室温条件下浸泡解冻，用纯化水清洗后放于4℃冰箱中浸泡24h；用手术刀轻轻刮取，除去牛跟腱表面的筋膜；

S2、前处理：将除去筋膜的牛跟腱继续于4℃冰箱中浸泡24h后，将牛跟腱放于负20℃冰箱冷冻，然后使用切片机对冻硬的牛跟腱进行切片，并称取重量，最后将牛跟腱腱片继续放于4℃冰箱中浸泡48h；

S3、碳酸盐处理：将浸泡后的牛跟腱腱片滤除水分后放于烧杯中，使用碳酸钠溶液于室温条件下搅拌清洗，每隔2h换液一次，连续清洗4h；滤除烧杯中的碳酸钠溶液，使用纯化水清洗腱片，每搅拌3min换液一次，并用PH试纸检测其内溶液PH值；

S4、磷酸盐处理：将清洗后的腱片放于新的烧杯中，向其内加入磷酸盐溶液，手动摇晃烧杯后，用保鲜膜封住烧杯口，并用酒精棉球擦拭烧杯表面灭菌后将其放于37℃细胞培养箱中，并每隔2h取出烧杯手动摇晃直至48h；期间每隔10h换液一次。

S5、酸溶：滤除烧杯中的磷酸盐溶液，将腱片收集于新的烧杯中，向烧杯内依次加入依地酸二钠溶液和醋酸溶液，再加入纯化水，于室温条件下搅拌5min后停止搅拌，静置24h；

S6、酶解：滤掉烧杯中的液体，开启电子搅拌器，于室温条件下，边搅拌边向烧杯中加入醋酸溶液、胃蛋白酶溶液，连续搅拌；22h后向烧杯内加入过氧化氢溶液，于室温下继续搅拌，终止酶解；

S7、除杂：使用30目筛网将胶原酶解液过滤到新的烧杯中，然后将其分装于50mL离心管中，使用高速离心机收集上清液于新的干净烧杯中；

S8、一次盐析：于4℃条件下向烧杯中加入氯化钠溶液，并使用玻璃棒轻轻搅拌，连续搅拌5min后停止搅拌，静置24h；

S9、胶原重溶：滤除烧杯中的液体，收集一次盐析出的白色絮状胶原于新的烧杯中，向烧杯内加入醋酸溶液，于4℃条件下连续搅拌24h；

S10、二次盐析：于4℃条件下向烧杯内加入氯化钠溶液，并使用玻璃棒轻轻搅拌，连续搅拌5min后停止搅拌，静置24h；

S11、透析：滤除烧杯中的液体，将二次盐析出的白色絮状胶原直接分装于透析袋中，于4℃条件下在装有纯化水的烧杯中进行透析，期间每隔12h换液一次，连续透析96h即可获得胶原原液。

2.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S1中，将牛跟腱放于装有800mL纯化水的1L烧杯中浸泡，每隔5分钟换水一次，连续换水清洗跟腱5遍，去除筋膜过程中，要用纱布连续擦拭牛跟腱表面无筋膜卷起为止。

3.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S2中，切片机厚度调控螺旋调节至2mm处，称取50g腱片用于后续试验，浸泡容器为1L烧杯，加纯化水500mL，浸泡48h过程中，5h后换液一次，再每隔9h换液一次，总共换水4次。

4.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S3中，碳酸钠溶液的容量为250mL，在室温下用搅拌器搅拌2h，用PH试纸测溶液PH值达到8.0左右时停止清洗。

5.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S4中，磷酸盐溶液的容量为250mL，手动摇晃时长为10-30min。

6.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S6中，过氧化氢溶液的自身浓度比为30％，过氧化氢溶液的用量占酶解液的10％，酶解液是1.5L，终止酶解时向烧杯内加入150ml 30％的过氧化氢，继续搅拌时长为2h。

7.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S7中，高速离心机的工作时长为30-40min。

8.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S8中，氯化钠溶液的含量为490mL，搅拌环境为4℃的冰箱内。

9.根据权利要求1所述的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述S9中，醋酸溶液的含量为1L，所述S10中，氯化钠溶液的含量为490mL。