[发明专利]一种山羊痘病毒的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种山羊痘病毒的定量检测方法。该方法，包括：首先用病毒特异性检测法对目标峰进行鉴定；然后用蛋白测定仪测定标准品的浓度；将此标准品进行系列稀释，在液相色谱仪上检测标准品在280nm处的吸收峰，建立浓度和峰面积的线性回归方程；根据线性回归方程和待测样品的峰面积计算得到待测样品中的山羊痘病毒的含量。本发明的方法可用于山羊痘病毒悬浮培养液、纯化液及山羊痘灭活疫苗中山羊痘病毒的含量测定，具有快速、准确、稳定、重复性好的优点，可指导疫苗的生产，对提高疫苗品质起到重要作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及病毒的检测及定量方法，具体涉及山羊痘病毒的定量检测方法。

背景技术

山羊痘病毒(Capripoxvirus，GPV)为痘病毒科，羊痘病毒属的一个成员，为双链DNA病毒，基因组呈线性，全长约150kb，编码147个开放阅读框。病毒基本的化学组成成分是蛋白质、DNA和脂类。病毒粒子为砖形，大小为300nm×270nm×200nm。GPV可以感染所有品种、性别和年龄的山羊，其中羔羊最易感，感染率可达100％。GPV通过接触痘疹破损后的皮肤、呼吸道的吸入或者媒介的传播而感染其他山羊，同群间传播迅速，但一般不向其他羊群散播。山羊痘病毒对干燥有较高的抵抗力，干燥痂皮内的病毒可以存活3个～6个月，在干热达100℃时，仍可存活5min左右。对常用消毒剂有较强的抵抗力，但500mL/L酒精和0.1g/LKMnO4可以在1h内将其灭活。对乙醚和氯仿敏感。反复冻融对其没有明显的灭活作用。

国内对该病毒的检测方法较少，目前对该病毒检测方法的研究主要涉及PCR法和TCID₅₀法。CN104152583B公开了一种山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。用两步扩增法检测目的靶序列。CN103215385B公开一种用于检测山羊痘病毒的试剂盒。试剂盒中至少包括有SEQ№1、SEQ№2、SEQ№3和SEQ№4四条引物，试剂盒内还有dNTP、Tris-HC、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20和Bst酶，以及模板DNA。以上两种方法均为基于核酸检测的方法，需要设计引物，并进行引物合成，且CN104152583B需要荧光染料，环境友好性方面有待提高，且只能定性样品中有无山羊痘病毒基因序列，无法对完整病毒进行准确定量。

TCID₅₀法操作繁琐，耗时长，需将病毒做多个稀释度后与细胞混合置于二氧化碳培养箱中培养7日，根据细胞病变数判定病毒的TCID₅₀(半数细胞感染量)。该方法对环境的无菌条件要求高，如操作不当，易引起细菌污染，导致试验失败。

随着山羊痘病毒相关疫苗的研究，急需开发一种操作简单，环境友好，重复性和再现性好的对完整山羊痘病毒的定量检测方法，用于山羊痘病毒生产的质量控制，提升山羊痘病毒疫苗产品品质。

HP-SEC(High Performance-Size Exclusion Chromatography高效尺寸排阻色谱)法是将高效液相色谱法和尺寸排阻色谱结合起来的色谱分离方法，采用凝胶色谱柱，根据被测物质的尺寸大小在高效液相色谱上实现有效分离，分离过程中不会对病毒造成损害。样品仅需简单离心，半小时内就可完成检测，多次检测的重复性非常好。

发明内容

本发明提供了一种操作简单、灵敏度高、重复性好的山羊痘病毒的检测方法。本发明根据山羊痘病毒的结构特征，设计采用凝胶柱分离的HP-SEC法，结合样品处理、标准品的制备以及检测条件优化，建立了高效的山羊痘病毒的定量检测方法，为山羊痘疫苗研发提供了质控标准。

本发明提供一种山羊痘病毒的定量检测方法，用于对待测样品中的山羊痘病毒进行定量检测，包括下述步骤：

(1)液相色谱检测山羊痘病毒样品，对目标峰进行特异性鉴定，制备标准品；

(2)用蛋白测定仪测定标准品中抗原浓度；