[发明专利]一种双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法

说明书

本发明涉及一种双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法，通过本发明所提供的方法，利用酵母展示技术与酵母交配系统，在酵母表面分别展示TCR文库、pMHC抗原文库，进而通过二倍体筛选和测序实现TCR和pMHC抗原序列的双向筛选。根据本发明所提供的方法，无需以往技术中耗时费力的纯化蛋白的步骤，可在短时间内双向筛选得到相互作用的特定TCR序列和特定pMHC抗原序列，且实验结果可靠。

技术领域

本发明涉及一种双向筛选相互作用的TCR和pMHC的方法，通过本发明所提供的方法，利用酵母展示技术与酵母交配系统，在酵母表面分别展示TCR文库、pMHC抗原文库，进而通过二倍体筛选和测序实现TCR和pMHC抗原序列的双向筛选。根据本发明所提供的方法，无需以往技术中耗时费力的纯化蛋白的步骤，可在短时间内双向筛选得到相互作用的特定TCR序列和特定pMHC抗原序列，且实验结果可靠。

背景技术

TCR(T cell receptors，TCR)是T细胞表面的特异性T细胞受体，是一种能够识别内/外源性抗原的分子，可以实现对特定受损伤细胞的杀伤和清除，同时可以介导免疫应答，在免疫应答和免疫调节中发挥着重要的作用。适应性免疫系统中，在T细胞识别抗原的过程中，受体TCR和主要组织相容性复合体(Major Histocompatibilty Complex,MHC)提呈的抗原分子多肽(pMHC或抗原-MHC复合物)之间密切结合，从而激活T细胞，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为活化的T细胞，产生对抗原的直接杀伤作用及活化T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用的免疫效应。肿瘤细胞免疫疗法(TCR-T)疗法就是利用与目标肿瘤抗原特异性结合的T细胞，从而实现杀伤、清除肿瘤细胞的治疗方法。

TCR识别pMHC激活免疫应答对于维持人体的健康至关重要，因此，生物学领域中对于TCR和pMHC相互作用强度的研究也一直是热点之一。目前研究方法主要有以下三种：

第一种方法是借助1996年美国John D.Altman等人(Phenotypic Analysis ofAntigen-Specific T Lymphocytes.Science 274,94–96(1996).)开发出的抗原-MHC复合物四聚体(简称：MHC四聚体)技术，一个MHC四聚体分子可与同一T细胞表面的3-4个TCR相识别并结合，从而大大增强了抗原-MHC复合物与TCR之间的结合力和检测特异性，并可通过流式细胞术成功实现对抗原特异性的T细胞的离体分析。通过该方式可以筛选与该MHC四聚体相互作用的TCR序列。在此基础上，Toebes等人于2006年进一步提出UV-诱导快速替换抗原肽技术(Toebes,M.,Coccoris,M.,Bins,A.,Rodenko,B.,Gomez,R.,Nieuwkoop,N.J.,Kasteele,W.van de,Rimmelzwaan,G.F.,Haanen,J.B.A.G.,Ovaa,H.,et al.(2006).Design and use of conditional MHC class I ligands.Nat.Med.12,246–251.)，该技术直接通过UV替换实现新的抗原肽与MHC蛋白的组装，简化了pMHC四聚体的构建过程。Hadrup等人于2009年提出一种多色荧光编码技术(Hadrup,S.R.,Bakker,A.H.,Shu,C.J.,Andersen,R.S.,Veluw,J.van,Hombrink,P.,Castermans,E.,Straten,P.thor,Blank,C.,Haanen,J.B.,et al.(2009).Parallel detection of antigen-specific T-cellresponses by multidimensional encoding of MHC multimers.Nat.Methods 6,520–526.)，该技术通过不用的荧光基团编码不同的pMHC蛋白，能够实现在一次流式细胞实验中检测到TCR与多个抗原的相互作用，该技术可以同时检测15个抗原的T细胞免疫反应。Bentzen等人于2016年开发了DNA条形码(DNA barcode)标记MHC多聚体的技术(Bentzen,A.K.,Marquard,A.M.,Lyngaa,R.,Saini,S.K.,Ramskov,S.,Donia,M.,Such,L.,Furness,A.J.S.,McGranahan,N.,Rosenthal,R.,et al.(2016).Large-scale detection ofantigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNAbarcodes.Nat.Biotechnol.34,1037–1045.)，该技术利用DNA barcode替代荧光基团，通过测序实现可与TCR结合的抗原序列的匹配，提高了实验筛选通量；Bentzen等人于2018年在上述技术的基础上，确定了16个不同TCR对1000多种不同pMHC的识别情况，再次提高了筛选通量(Bentzen,A.K.,Such,L.,Jensen,K.K.,Marquard,A.M.,Jessen,L.E.,Miller,N.J.,Church,C.D.,Lyngaa,R.,Koelle,D.M.,Becker,J.C.,et al.(2018).T cell receptorfingerprinting enables in-depth characterization of the interactionsgoverning recognition of peptide–MHC complexes.Nat.Biotechnol.)。然而第一种方法需要提前确定抗原信息，并且筛选通量有限。