[发明专利]一种含氧多环芳烃类物质对水生生物毒性效应的试验方法

权利要求书

1.一种含氧多环芳烃类物质对水生生物毒性效应的试验方法，其特征在于，包括含氧多环芳烃对斜生四链藻的毒性效应的试验方法、含氧多环芳烃对大型溞的毒性效应的试验方法以及含氧多环芳烃对斑马鱼的毒性效应的试验方法；

其中，含氧多环芳烃对斜生四链藻的毒性效应的试验方法包括如下步骤：

S1、前处理：在无菌条件下接种适量处于对数增长期的斜生四链藻藻液于锥形瓶中使得锥形瓶中最终藻液体积为50mL，并且初始藻细胞数约为(2–5)×10³cells/mL，加入OPAHs，用透气膜封口，打乱顺序置于光照培养箱(14h光照：10h黑暗、23±2℃)中培养96h，每日摇动5–6次并更换位置以减少光照不均匀和细胞贴壁对细胞生长产生的影响；

S2、含氧多环芳烃对斜生四链藻生长速率的影响：培养96h后，于650nm波长下，测定藻悬浮液的吸光度，通过细胞浓度-吸光度关系公式可计算出细胞浓度，与对照组进行比较，可计算出各浓度组藻细胞生长抑制率；

S3、含氧多环芳烃对斜生四链藻细胞膜通透性的影响：利用二乙酸荧光素FDA其本身无荧光，但可穿透细胞膜并被细胞中的非特异性酯酶分解产生荧光素的特性测定细胞膜通透性，荧光素是亲水性的，通过产生荧光素的荧光强度既反映了酯酶活性又反映了细胞膜的完整性，培养96h后，从光照培养箱中取出藻液，离心藻细胞并使其重新在培养液中悬浮以获得4×10⁵cells/mL的最终细胞浓度，避光适应室温20℃；以丙酮为溶剂制备FDA溶液现配现用，取10mL藻液于小管中并添加10μL的FDA溶液，最终FDA的浓度为3×10^-6M，混匀使FDA和藻细胞能充分接触，用荧光分光光度计监测前10min内荧光强度的变化情况；仪器参数如下：时间扫描，600s；激发波长E_x＝485nm；发射波长E_m＝530nm；仪器每隔1s记录一次荧光强度，通过对荧光强度与时间进行线性回归拟合(R²≥0.950)，其斜率为FDA被酯酶分解为荧光素的平均速率，以此数据来代表藻细胞的通透性；在没有细胞的对照组中，荧光强度始终为0，未监测到FDA水解；所有浓度组均有三个平行，在4h的测量期内，藻类处于黑暗中，细胞生长量和细胞通透性变化量忽略不计；

S4、含氧多环芳烃对斜生四链藻光合色素的影响：光合色素密切参与捕获、转递光能等过程，是斜生四链藻进行光合作用的基础，叶绿素a和总叶绿素含量能够一定程度上反映出生物进行光合作用的能力；培养96h后，收集10mL斜生四链藻藻液于离心管中，在4000rpm下离心10min，移除上清液收集藻细胞，加入5mL 90％(v/v)丙酮溶液，用封口膜封口并用锡纸遮光，充分混匀后在4℃的黑暗条件下提取24h，8000rpm离心10min清除颗粒获得上清液；以90％的丙酮溶液为参比，测量上清液在663nm、645nm和750nm处的吸光度，上清液在750nm处吸光度需小于0.05，以此来排除溶液内杂物对吸光度测定的干扰；利用以下公式计算叶绿素a和总叶绿素的含量：

C_a＝(12.7A_663nm-2.69A_645nm)/ρ

C=(8.02A_663mm+20.2A_645nm)ρ

式中，C_a、C——叶绿素a浓度和总叶绿素浓度，μg/cells；

A_663nm、A_645nm——上清液在663nm和645nm处的吸光度；

ρ——藻细胞浓度，cells/mL。