[发明专利]一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法

说明书

本申请公开了一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法。本申请的活性检测方法，采用待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2和催化剂NAD+辅助因子对反应底物5,10‑亚甲基四氢叶酸进行反应，反应过程中，对反应产物进行340nM紫外吸光值检测，根据340nM紫外吸光值计算反应产物中NADH含量，根据不同反应时间后的NADH含量计算亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性。本申请的方法，只需检测反应产物中的340nM紫外吸光值，根据NADH标准曲线，即可获得反应产物中NADH含量，从而计算获得亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性。本申请方法，极大的缩短了检测时间，能够更好的适用于需要快速检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的场景。

技术领域

本申请涉及多肽活性检测技术领域，特别是涉及一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法。

背景技术

亚甲基四氢叶酸脱氢酶2(MTHFD2)，又称为亚甲基四氢叶酸环水解酶，是一种具有亚甲基四氢叶酸脱氢酶及环化水解酶双重活性的双功能酶，在线粒体叶酸代谢中呈高表达水平。研究显示，MTHFD2的活性与多种类型肿瘤的发生和发展密切相关；因此，MTHFD2活性检测对肿瘤研究具有重要意义。

目前普遍使用的MTHFD2活性检测方法是，使用催化剂NAD+辅助因子和MTHFD2对5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢进行催化，在常温反应30min后，最终生成NADH，使用NADH-GLODetection system与生成的NADH在常温反应60min，然后，使用酶标仪检测化学发光信号；根据所检测到的化学发光信号判断NADH的量，进而判断MTHFD2的活性。该方法虽然能够比较有效的检测MTHFD2活性；但是，反应时间较长，需要至少90min；并且，反应条件受到化学发光试剂的性质限制，需要购买GLO Detection system检测试剂等。

因此，如何研发更简单方便，且快速的MTHFD2活性检测方法，是亟待解决的问题。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2抗体活性的方法。

本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法，其包括采用待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2和催化剂NAD+辅助因子对反应底物5,10-亚甲基四氢叶酸进行脱氢催化反应，反应过程中，对反应产物进行340nM的紫外吸光值检测，根据检测的340nM紫外吸光值来计算反应产物中NADH的含量，并根据不同反应时间后的反应产物中NADH的含量计算待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。

需要说明的是，本申请研究发现NAD+在260nM的紫外吸光值比较高，而NADH在340nM紫外吸光度比较高；因此，可以直接利用以上特征，检测反应产物在340nM的紫外吸光值，以此计算反应产物中NADH的含量，从而计算亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。可以理解，本申请的活性检测方法，只需要检测340nM的紫外吸光值即可，无需额外使用GLODetection system等检测试剂，不仅节省了检测成本，也省略了NADH-GLO Detectionsystem与NADH的反应时间，使得本申请的检测方法能够更简单方便，且快速的检测MTHFD2活性。

本申请的一种实现方式中，根据检测的340nM紫外吸光值计算反应产物中NADH的含量，具体包括，采用若干个已知浓度的NADH进行340nM紫外吸光值检测，根据检测结果绘制NADH浓度与340nM紫外吸光值的拟合曲线，即获得NADH标准曲线，根据检测的反应产物的340nM紫外吸光值和NADH标准曲线计算反应产物中NADH的含量。

本申请的一种实现方式中，NADH标准曲线由2.5mmol/L的NADH，以2倍梯度稀释，总计获得6个已知浓度的NADH进行340nM紫外吸光值检测，根据6个NADH的检测结果绘制获得。

本申请的一种实现方式中，NADH标准曲线的拟合公式为Y＝0.9831X-0.0361，X是NADH浓度，Y是340nM的紫外吸光值。