[发明专利]一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法

权利要求书

1.一种检测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的方法，其特征在于：包括采用待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2和催化剂NAD+辅助因子对反应底物5,10-亚甲基四氢叶酸进行脱氢催化反应，反应过程中，对反应产物进行340nM的紫外吸光值检测，根据检测的340nM紫外吸光值计算反应产物中NADH的含量，根据不同反应时间后的反应产物中NADH的含量计算待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述根据检测的340nM紫外吸光值计算反应产物中NADH的含量，具体包括，采用若干个已知浓度的NADH进行340nM紫外吸光值检测，根据检测结果绘制NADH浓度与340nM紫外吸光值的拟合曲线，即获得NADH标准曲线，根据检测的所述反应产物的340nM紫外吸光值和NADH标准曲线计算反应产物中NADH的含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述NADH标准曲线由2.5mmol/L的NADH，以2倍梯度稀释，总计获得6个已知浓度的NADH进行340nM紫外吸光值检测，根据6个NADH的检测结果绘制获得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述NADH标准曲线的拟合公式为Y＝0.9831X-0.0361，X为NADH浓度，Y为340nM的紫外吸光值。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述根据不同反应时间后的反应产物中NADH的含量计算待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性，具体包括，

1)检测340nM的紫外吸光度，根据所述NADH标准曲线的拟合公式，计算MTHFD2酶反应产生的NADH含量；

2)固定底物的浓度和NAD+浓度，加入不同浓度的酶量，常温酶标仪30s动力循环检测一次340nM的紫外吸光度，后用实验组减去不含MTHFD2酶的对照组，按照NADH标曲的拟合公式计算出NADH含量，取4min之内的值制作曲线；

3)对4min之内的不同时间对应的NADH含量进行拟合，拟合曲线的斜率为反应速度V，换算成标准单位pmol/min，制作反应酶量和反应速度的曲线图；

4)固定酶量和NAD+浓度，改变底物5,10-亚甲基四氢叶酸的浓度，常温酶标仪30s动力循环检测一次340nM的紫外吸光度，根据步骤2)和步骤3)的计算方法得出反应速度和底物浓度的关系，换算成标准单位pmol/min/ug，制作曲线图，使用Prism 7软件计算Km值；以Km表征待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的亲和力，Km越小，亲和力越大，酶活性越强，Km越大，亲和力越小，酶活性越小。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：还包括，在计算获得反应产物中NADH的含量后，根据抑制率公式计算不同时间、不同浓度的抑制剂LY345899对待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2活性的抑制率，使用Prism 7软件计算LY345899的IC50，以此表征待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的活性。

7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述催化剂NAD+辅助因子的浓度为200-500μmol/L。

8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述反应底物5,10-亚甲基四氢叶酸的浓度为100-500μmol/L。

9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述待测亚甲基四氢叶酸脱氢酶2的浓度为10-50nmol/L。