[发明专利]毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法

说明书

本发明公开了毛发中褪黑素、N‑乙酰血清素、6‑羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法，步骤包括：(1)采集人体毛发样本并清洗；(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物的含量检测。本发明基于高效液相色谱串联电喷雾离子化源质谱，建立了一种同时提取和检测毛发基质中褪黑素、N‑乙酰血清素、6‑羟基褪黑素、皮质醇和可的松的新方法，并且该方法操作简便、灵敏度高、特异性好，是一种全新的尝试。

技术领域

本发明涉及化合物的提取和检测方法，特别涉及毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法。

背景技术

睡眠是人体重要的生理过程，长期睡眠状况对人的身体和精神健康都有着重大影响。褪黑素和皮质醇是能够调节人体的睡眠、生物节律、免疫等多种生理功能的激素，并且它们的内源性分泌均遵从昼夜节律。松果体分泌的褪黑素呈现白天分泌少、夜间分泌多的规律，午夜时分在人类体内循环系统中的浓度最高；皮质醇则是夜间分泌极少，晨醒后半小时分泌达到峰值，而后逐渐下降。褪黑素和皮质醇与睡眠之间存在紧密关联，可作为睡眠状态的生物标志物。然而，褪黑素和皮质醇在人体内易快速代谢，这导致这两者具有含量低，且个体间差异巨大的缺陷。由于6-羟基褪黑素、N-乙酰血清素及可的松分别作为褪黑素和皮质醇的主要代谢物，其含量相对稳定，个体差异较小，且在人体内的分泌和它们的前体一样存在昼夜节律性，因此也有可能成为睡眠状态的生物标志物，弥补褪黑素和皮质醇的局限性。

在实际应用中，广泛地采用血清、血浆、唾液或尿液作为生物基质进行褪黑素、皮质醇及其代谢物的检测，但这些基质也有一定的局限性。其中血液中的激素含量波动大，容易受到环境因素干扰，且采集血样的过程有可能引起受试者应激，使结果不可靠；唾液和尿液则可以避免应激，但二者与血液同样为流体基质，有着即时性强的特点，都只能反映某个时间点的激素水平或过去较短时间段内的激素总量。如果希望通过此类基质反映长期状况，就需要对受试者进行长期的连续重复采样，过程繁琐、操作复杂。

相较于流体基质，毛发作为固体基质，其中的激素含量更稳定，更能反映激素的长期累积水平，而且毛发样本采集简便、保存要求低、生长速度均匀，便于匹配发段位置和期待的时间窗口。毛发中的内源性物质主要来源于血液中游离物质的被动扩散，所反映的是血液中游离的内源性物质的长期水平。

当前检测褪黑素、皮质醇及他们的代谢物的主要手段有免疫法、高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法。免疫法虽然灵敏度高且经济便捷，但可能发生交叉反应影响结果，而且不能同时检测多种物质。高效液相色谱法常与紫外或荧光检测器联用，但此种方法往往需要预先进行富集和衍生化，操作复杂。考虑到毛发中的物质含量远低于流体基质，灵敏度高、特异性好的高效液相色谱串联质谱法或许更适合。此外，褪黑素及其代谢物的热稳定性相对较低。在以前单独分析头发皮质醇的样本提取中孵育温度往往较高，多在40度以上，以前的提取方法可能不适合褪黑素及其代谢物的提取。因此，本发明旨在建立一种同时提取和检测毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松的液相色谱串联质谱法。

发明内容

发明目的：本发明提供一种灵敏度高、特异性好、准确可靠的，基于高效液相色谱串联质谱技术的涉及毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法。

技术方案：本发明的毛发中褪黑素、N-乙酰血清素、6-羟基褪黑素、皮质醇和可的松同时提取和检测方法包括以下步骤：

(1)采集人体毛发样本并预处理；

(2)孵育、萃取样本以提取样本中的目标物；

(3)使用高效液相色谱串联质谱法实现目标物含量的检测。