[发明专利]一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及生物传感及其材料制备技术领域，具体来说是一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法及其应用，包括用Au/TiO₂/Fe₃O₄纳米球制备适配体修饰CD63探针、用Ag/4‑ATP/Au SERS标签制备适配体修饰PDL1探针，以及将该探针以“三明治夹心”的方法在SERS特异性检测PDL1中的应用。本申请通过同时使用SERS和ELISA测试探测外泌体PDL1，证明其测量PDL1在动物体内表达时间依赖性变化；且原始血清样本分析结果显示，SERS方法探测循环外泌体PDL1的诊断灵敏度可达98％，表明本申请的SERS方法具有卓越灵敏度和准确度。采用本发明适配体探针结合SERS夹心法量化血清中PDL1生物标志物，具有特异性强、灵敏度高、选择性好等优点，且操作简单、方便、快捷，在基于PDL1/PD1的免疫疗法的监测中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物传感及其材料制备技术领域，具体来说是一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法及其应用。

背景技术

恶性细胞通过包括释放细胞因子，如肿瘤生长因子(TGF-β)或白细胞介素10(IL-10)，或者改变肿瘤相关巨噬细胞和细胞表面标志物的不同表达等多种途径绕过免疫系统观察，这会通过刺激有利于癌症转移的免疫抑制状态来破坏与恶性细胞的平衡。癌细胞会进一步吸收调节性T细胞(通常称为Treg)，这有助于下调肿瘤抗原表达，并促进细胞凋亡。这会导致免疫抑制检查点(即PDL1、CTLA-4、VISTA和B7-H4)激活，这些检查点与T细胞中的共抑制受体结合从而限制免疫反应系统。这些机制综合结果导致肿瘤微环境的形成，也是导致癌症相关疫苗缺乏有效诊断和治疗效率的一个重要原因。

程序性细胞死亡配体1(PDL1)及其首要的靶点PD-1是两个关键的免疫检查点，它们结合在一起以促进肿瘤生长和转移。事实上，多种证据表明，癌细胞会分泌小尺寸的囊泡(10-100nm)，通常称其为外泌体，它有更高的PDL1表达，可以与T细胞上的PD-1相互作用以终止其抗肿瘤反应。这些外泌体富含肿瘤外PDL1和其他细胞粘附生物标志物，如整联蛋白(CD63、CD81、CD82)，是导致抗PD-1/PDL1免疫治疗的机制之一。还有报道称，患者外周血中癌症分泌的外泌体中存在高水平的PDL1表达也与疾病分期相关，这表明外泌体可能是癌症的潜在来源。因此，外泌体PDL1分析已成为与开发有效和敏感的诊断工具相关的主要课题。以前，已经使用了广泛的分析工具，例如质谱法、流式细胞术和组织化学方法，但是这些方法操作繁琐、耗时费力。所以，还亟需其它测试方法，以对实际情况进行快速、现场和定量监测。目前，在临床水平对PDL1表达快速检测仍具有挑战性。

据调研，公告号为CN 109387499 B的中国专利公开了一种将石墨烯金属氧化物复合材料PDL1探针及其制备方法，其使用SERS作为替代工具，通过基于目标特异性适体-纳米粒子的探针的能力提供具有更高结合精度和目标识别的高灵敏度，用于PDL1的定量检测。但该方法在检测时，需要对细胞进行离心处理，而且也无法用于采血样品直接测量。本申请采用“三明治夹心”的方法，通过对SERS基底进行适配体修饰，开发了功能化探针以特异性地靶向血清中的循环外泌体的PDL1，检测时，利用外磁场作用实现在血液中直接测量，且利用标签信号实现了PDL1的定量检测，与传统抗体相比具有优越的特性，例如对靶标的亲和力强(检测特异性好)、稳定性好、体积小、易于合成、降低生产成本等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种适配体修饰的磁性复合材料SERS基底，以“三明治夹心”方法将其用于表面增强拉曼光谱特异性定量检测血液中PDL1，具有测量简单、特异性强、灵敏度高、选择性好等优点。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

本发明一方面公开了一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备CD63探针