[发明专利]一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种PDL1的适配体功能化SERS探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、制备CD63探针

S1-1、磁性复合材料Au/TiO₂/Fe₃O₄的制备

a.制备Fe₃O₄纳米球：在磁力搅拌下，将FeCl₃·6H₂O、柠檬酸三钠和NaAc(醋酸钠)完全溶解在乙二醇中，然后将上述混合物转移到高压釜中加热，对得到的黑色产物进行洗涤、密封干燥，得到Fe₃O₄纳米球；

b.修饰Fe₃O₄纳米球：将干燥的Fe₃O₄纳米球和氨水溶解在乙醇中，加热并搅拌上述混合物，同时将稀释在乙醇中的TBOT(钛酸四丁酯)滴加到混合物中，待混合物降至室温，继续搅拌20-28小时；

对搅拌产物进行洗涤、干燥，在超声水浴下将干燥产物溶解在乙醇中，然后添加APTMS(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)并再次超声处理；将上述混合溶液加热回流，并对回流产物进行洗涤，再分散在乙醇中得到修饰Fe₃O₄纳米球；

c.制备Au/TiO₂/Fe₃O₄纳米球：调节修饰Fe₃O₄纳米球的pH至4.5-5.5，搅拌的同时将经过APTMS稳定的TiO₂/Fe₃O₄纳米球添加到Au纳米颗粒中，并继续搅拌15-25分钟；使用外磁场分离，对获得的产物进行洗涤并溶解在水中，得到Au/TiO₂/Fe₃O₄纳米球；

S1-2、适配体修饰CD63探针

将硫醇化的CD63适配体溶解在无核酸酶的水中，并在93-98℃的水浴中加热10-15分钟，随后立即浸入冰水浴中25-35分钟；再将TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述CD63适配体溶液中，使CD63适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5-2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；

将等体积的脱盐CD63适配体溶液与Au/TiO₂/Fe₃O₄纳米球混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小时；使用外部磁场分离，将收集产物用无核酸酶水洗涤，并与MCH(平均红细胞血红蛋白量)再次在3.5-4.5℃下孵育1.5-2.5小时，最后对孵育产物再次洗涤得到适配体修饰CD63探针，并在3.5-4.5℃温度下储存；

S2、制备PDL1探针

S2-1、Ag/4-ATP/Au SERS标签的制备

配制0.01-0.02mol/L的4-ATP水溶液，并在3.5-4.5℃下储存4-5小时；

将4-ATP添加到Au纳米颗粒中，并对混合物进行磁力搅拌，而后将混合溶液在3.5-4.5℃下孵育4-5小时并用去离子水洗涤；

然后将抗坏血酸添加到4-ATP功能化的Au纳米球中，逐滴添加AgNO₃，当溶液颜色从红色变为浅橙色时，停止搅拌并用去离子水洗涤产物，得到Ag/4-ATP/Au SERS标签。

S2-2、适配体修饰的PDL1探针

将硫醇化的PDL1适配体溶液溶解在无核酸酶的水中，并在90-100℃的水浴中加热10-15分钟，随后立即浸入冰水浴中25-30分钟；再将TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述PDL1适配体溶液中，使PDL1适配体脱盐；然后将混合物在室温下孵育1.5-2.5小时，并用无核酸酶的水洗涤；

将等体积的脱盐PDL1适配体溶液与Ag/4-ATP/Au SERS标签混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小时；对孵育产物进行离心，并用无核酸酶水洗涤；然后将洗涤后的溶液与MCH(平均红细胞血红蛋白量)在3.5-4.5℃下混合1.5-2.5小时，同时进行离心；最后对孵育产物再次洗涤，得到适配体修饰PDL1探针，并在3.5-4.5℃温度下储存。