[发明专利]一种长春花来源外泌体纳米囊泡及其在免疫调节方面的应用

权利要求书

1.一种具有免疫活性的长春花外泌体纳米囊泡，包括长春花叶片来源外泌体样纳米囊泡、长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊泡、长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡；长春花茎来源外泌体样纳米囊泡。

2.一种包含权利要求1所述的长春花外泌体纳米囊泡以及药学上可接受载体的药物组合物。

3.如权利要求1、2所述的长春花外泌体纳米囊泡在制备用于免疫调节活性药物的用途；优选地，所述药物组合物在制备用于辅助治疗直肠癌药物的用途。

4.如权利要求1-3任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡，其特征在于，长春花外泌体纳米囊泡有载药功能，可以进行跨物种的通讯和调控。

5.如权利要求1-4任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡，其特征在于，所述长春花外泌体纳米囊泡在制备无需肠溶包衣的普通口服药物制剂的用途，能够耐受强酸、强碱、以及耐受RNA酶、DNA酶以及蛋白酶的消化而不失去活性。

6.如权利要求1-5任一项所述长春花外泌体纳米囊泡包括长春花叶片来源外泌体纳米囊泡和长春花茎形成层干细胞来源外泌体样纳米囊泡。

7.如权利要求1-6任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡，其中长春花叶片来源的外泌体纳米囊泡制备方法如下：

1)长春花叶片的酶解：采摘新鲜的长春花叶片，冲洗擦干。配制含有纤维素酶(每100毫升3克)和果胶酶(每100毫升0.2克)，pH在5.75～5.80之间的酶解液。每2g叶子加入100ml酶解溶液，并在25℃下，在摇床上以100rpm的速度在黑暗中孵育至少12h。静置，留取上层液体，以1000rpm离心20min除去杂质。然后在4℃条件下10000rpm离心40min，重复离心3次，取上清液，用中空纤维透析管浓缩至100ml备用。

2)一步法蔗糖垫超速离心：将7ml 0.971M蔗糖添加到超速离心管底部，然后加入样品至灌满离心管。4℃，150000×g离心90min。收集蔗糖层，加入20ml经0.22μm微孔膜过滤的磷酸盐缓冲液(PBS)，经30KDa超滤膜超滤离心去除蔗糖，浓缩至2ml，既得CLEN。

3)CLEN的定量及储存：使用BCA蛋白质定量试剂盒(Beyotime)基于蛋白质浓度对CLEN进行定量。新提取的囊泡可在4℃下暂时保存，对于需要长期储存的纳米囊泡，将它们悬浮在无菌PBS中，并在-80℃环境中储存直至使用。

8.如权利要求1-7任一项所述的长春花外泌体纳米囊泡在制备用于肠溶包衣药物口服制剂的用途。

9.如权利要求8所述长春花外泌体纳米囊泡包括长春花叶片愈伤组织来源外泌体样纳米囊泡和长春花茎来源外泌体样纳米囊泡。