[发明专利]检测小胶质细胞的核酸适体及应用

说明书

一种检测小胶质细胞的核酸适体及应用，制备的核酸适体具有独特的茎环结构，并通过流式检测发现其具有较高的结合亲和力和特异性，能特异性识别小胶质细胞，不识别非小胶质细胞。筛选获得的核酸适体可以进一步截短优化，分子量小，节约了合成成本，提高了亲和力，易修饰改造，无细胞毒性，结合特异型强，无免疫原性，稳定性高，且核酸适体识别小胶质细胞的分子靶点为跨膜蛋白CD64,其在LPS以及IFN‑γ炎性刺激下表达上升，从而使该适体与炎性活化的小胶质细胞亲和性更高。上述优点使得所述核酸适体作为小胶质细胞特异性识别分子探针，用于诊断和靶向调节CD64蛋白相关疾病具有重要的潜力。

技术领域

本发明具体涉及分子生物学技术领域，具体涉及检测小胶质细胞的核酸适体及应用。

背景技术

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的常驻组织免疫细胞。小胶质细胞失稳态及功能异常导致的神经炎症已被证明是创伤性中枢神经系统继发性损伤和神经退行性疾病病理的关键因素。针对小胶质细胞的重要调节特性，开发一种识别及靶向小胶质细胞的分子工具无疑对临床诊断及治疗具有很大的价值和意义。

在鉴定小胶质细胞方面，传统方法是用抗体筛选小胶质细胞标志物，某几种抗原表达阳性即表示该细胞为小胶质细胞。这种方式可以在一定程度上区分小胶质细胞与其他细胞，但是部分小胶质细胞稳态条件下的标志物在疾病发展中对小胶质细胞的鉴定可能是不可靠的，例如小胶质细胞稳态基因包括Tmem119, P2ry12和Siglech在中枢神经系统疾病中下调，这可能会进一步限制对应抗体的使用；目前并无可以作为神经炎症状态下小胶质细胞稳定特异性标记的抗体结合靶点。同时抗体也具有生产成本高，周期长，价格昂贵的劣势；在体内靶向小胶质细胞方面，可用的分子工具也非常局限。例如作为靶向神经元首选方法的重组病毒如慢病毒和腺相关病毒(AAV)是，在体内转导小胶质细胞的效率却非常低。至于转基因小鼠靶向标记小胶质细，劣势也是非常明显：生产周期长，成本昂贵以及不可预测性结果等等。

核酸适体具有体积小、特异性强、稳定性高、免疫原性低、易于修饰、构建靶向递送等优点，具有作为靶向识别、标记小胶质细胞的潜力。核酸适体是具有20-100个核苷酸长度的单链DNA或RNA，通过指数富集(SELEX)方法对配体进行系统进化筛选得到，可以形成三维结构特异地结合到目标分子上。核酸适体最显著的特征如下：1）首先，适体介导的分子识别具有很高的特异性，可以用于区分细微的分子差异。对这一概念的证明是使用适体来区分三种不同但密切相关且形态相似的急性髓系白血病(AML)细胞。这种准确区分分子特征的能力，有助于阐明发病机制相关的分子基础。2）Cell-SELEX是为了能够模拟真实环境中的活细胞而开发的，它能够为任何感兴趣的细胞生成适体，而不需要依赖其先前的分子特征知识。因此，Cell-SELEX可用于发现以前未知的生物标志物，或其在发病机制中尚未被认识的特征；3）核酸适体易于修饰，可增强其体内稳定性；同时能偶联其他药物、分子或纳米颗粒，与细胞膜上的受体结合后，能介导自身或偶联颗粒进入细胞，可作为药物递送的理想靶向分子工具。 例如，来自间充质干细胞(MSC)的外泌体与对髓鞘高度亲和性的特异性适体结合，在体外诱导少突胶质细胞OLN93增殖，并抑制炎症反应，在体内降低脱髓鞘病变。

然而据我们所知，目前还没有小胶质细胞特异性核酸适体的报道，尽管已有报道靶向人类单核细胞和巨噬细胞的核酸适体A2（Sylvestre, M.; Saxby, C. P.;Kacherovsky, N.; Gustafson, H.; Salipante, S. J.; Pun, S. H. Identificationof a DNA Aptamer That Binds to Human Monocytes and Macrophages. BioconjugChem 2020, 31 (8), 1899-1907），但其并不结合小胶质细胞。

发明内容

为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了检测小胶质细胞的核酸适体及应用，具有识别靶向调控小胶质细胞的作用，为调控炎性活化小胶质细胞表型并减轻炎症相关疾病提供新的分子工具。