[发明专利]一种脂肪间充质干细胞冻存保护液及冻存方法

说明书

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，包括基础培养基和添加在培养基中的以下成分：甘油、普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇、维生素C、胰岛素；各成分在培养基中的终浓度为：甘油20‑30μg/mL、普鲁卡因微囊1‑5ng/mL、香柑内酯3‑8ng/mL、白藜芦醇5‑10μg/mL、维生素C1‑2mg/mL、胰岛素0.5‑1mg/mL。本发明提供的保护液中添加普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇等成分，减少细胞经冻存后的损伤，提高细胞的存活率，经冻存后的细胞仍具有较好的增殖活性，保存液中各成分安全稳定，有助于细胞的长期保存。本发明还提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，提高了细胞的保存效率，充分保证了脂肪间充质干细胞在各领域的应用。

技术领域

本发明涉及一种细胞冻存保护液，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞冻存保护液及冻存方法。

背景技术

间充质干细胞存在于骨髓、脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等多种组织中。研究发现，间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，有显著临床应用优势。

肪间充质干细胞是指来源于脂肪组织的一类间充质干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，其能够向骨，软骨，脂肪，肌肉，神经，内皮等方向分化。同时，脂肪间充质干细胞来源广泛，脂肪组织可通过脂肪抽吸术或外科手术容易获取，对供者创伤较小且不涉及伦理问题，免疫原性低，且可以在体外条件下大量扩增，现已是组织工程领域最受欢迎的干细胞之一。

由于要得到大量的肪间充质干细胞往往需要较长的培养周期，并且细胞移植的供体与受体通常存在异地的可能性，很难保证细胞的及时使用，而充足的脂肪间充质干细胞数量是决定是否能达到临床疗效的重要因素之一。要实现随时为临床和基础研究提供足量脂肪间充质干细胞，需要对细胞在液氮中进行冻存。细胞冻存是指即使细胞暂时脱离生长状态而将细胞长时间保存起来，并维持细胞原有的生物学特性，在需要时经过快速复苏可正常使用。

在冻存过程中为了减少对细胞造成的损伤，通常会添加保护液，目前常用的有二甲基亚砜，二甲基亚砜是一种有毒试剂，与蛋白质的疏水基团发生作用，可导致蛋白质变性，存在一定的安全隐患，因此有必要提供一种安全稳定的保护液用于脂肪间充质干细胞的冻存。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，不添加DMSO，成分安全稳定。

本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，包括基础培养基和添加在培养基中的以下成分：甘油、普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇、维生素C、胰岛素；各成分在培养基中的终浓度为：甘油20-30μg/mL、普鲁卡因微囊1-5ng/mL、香柑内酯3-8ng/mL、白藜芦醇5-10μg/mL、维生素C1-2mg/mL、胰岛素0.5-1mg/mL。

进一步地，各成分在培养基中的终浓度为：甘油25μg/mL、普鲁卡因微囊3ng/mL、香柑内酯5ng/mL、白藜芦醇8μg/mL、维生素C1.5mg/mL、胰岛素0.7mg/mL。

进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12。

进一步地，所述普鲁卡因微囊的制备方法如下：取壁材溶解于无水乙醇中，壁材的质量浓度为1-2％，加入芯材普鲁卡因粉末，混合均匀后经喷雾干燥得到普鲁卡因微囊。

进一步地，所述壁材为羧甲基纤维素钠，所述羧甲基纤维素钠和普鲁卡因粉末的质量比为1:0.2-0.3。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用上述保护液冻存。